重组质粒pUDK-HGF的中试纯化工艺

胡春生，王延亮，卢育新，程晓晨，刘琳，张通，张庆林

1 军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京 100850

2 内蒙古工业大学化工学院，呼和浩特 010051

重组质粒pUDK-HGF的中试纯化工艺

胡春生1,2，王延亮1，卢育新1，程晓晨1，刘琳1，张通2，张庆林1

1 军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京 100850

2 内蒙古工业大学化工学院，呼和浩特 010051

pUDK-HGF是携带人肝细胞生长因子的裸质粒，目前已进入I期临床试验，因此需要大量符合药学规格的质粒DNA。文中建立了pUDK-HGF中试规模纯化制备的新工艺。流程包括：发酵、离心收获菌体、碱裂解、超滤浓缩碱裂解液、Sephacryl S-1000层析除去RNA并更换缓冲液、plasmidselect捕获超螺旋质粒DNA、琼脂糖凝胶6BFF除盐。新工艺可获得浓度为2.0 mg/mL、纯度在1.70以上的裸质粒原液，符合相关质量标准，并避免使用动物源性的酶及有毒试剂。

重组质粒，纯化，质量检测，肝细胞生长因子

Abstract:pUDK-HGF, the recombinant plasmid DNA encoding human hepatocyte growth factor (HGF), can treat ischaemic disease. A great quantity of pharmaceutical pUDK-HGF is needed. A pilot-scale production process of pUDK-HGF was established based on a new chromatographic media (plasmidselect), including fermentation, cell harvesting, alkaline lysis, ultrafiltration, RNA removing and buffer exchanging on Sephacryl S-1000, capturing supercoiled plasmid DNA with plasmidselect, and removing the salt with Sepharose 6BFF. The process does not use RNase enzyme and toxic solvents.

Keywords:recombinant plasmid, purification, hepatocyte growth factor

肝细胞生长因子 (Hepatocyte growth factor，HGF) 是一类多功能生长因子，具有刺激血管增生作用，通过局部肌肉注射携带HGF基因的质粒DNA可明显促进肢体急性缺血部位新生血管的形成，在临床上具有治疗缺血性疾病的应用前景[1]。

Zhang等[2]对质粒pUDK-HGF大规模纯化工艺进行了大量研究，工艺成熟，能生产药用级重组质粒pUDK-HGF注射液。其工艺是碱裂解后离心处理获得澄清碱裂解液，直接用Q-Sepharose XL阴离子交换层析捕获质粒DNA；再用Sephacryl S-1000分离除去RNA；用Source 15Q对质粒DNA进行精制。随着新填料 plasmidselect的出现，生产超螺旋质粒 DNA的工艺随之更新，因此本文建立新的pUDK-HGF纯化工艺，该工艺为碱裂解细菌后，用绸布滤去细胞碎片等絮凝物，获得碱裂解上清液；上清液经300 kDa超滤柱进行浓缩，获得的浓缩液经 Sephacryl S-1000层析柱除去 RNA，然后通过plasmidselect层析柱对超螺旋质粒DNA进行捕获，获得高纯度的超螺旋质粒DNA，再通过琼脂糖凝胶6BFF对超螺旋质粒DNA进行脱盐；最终采用异丙醇沉淀质粒DNA，75%乙醇洗涤，配方溶液重溶获得产品。

1 材料与方法

1.1 菌株

表达重组人肝细胞生长因子的基因工程菌E. coli DH5α-pUDK-HGF 由本室构建，−80 ℃甘油保存。

1.2 材料

Tris(Angus)、DNAGreen (北京天恩泽基因科技有限公司)、十二烷基硫酸钠 (Amresco)、限制性内切酶 (TaKaRa)、胰蛋白胨 (OXOID)、酵母提取物(OXOID)、甘油、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、盐酸、氨水、硫酸铵、乙二胺四乙酸二钠、乙酸钾、氢氧化钠、冰乙酸、异丙醇、乙醇、葡萄糖 (以上化学试剂均来自国药集团化学试剂有限公司，分析纯)。

1.3 发酵

E. coli DH5α-pUDK-HGF菌种经 LB培养基[3]摇床培养12 h，以接种量10%转入含TB培养基[3]50 L发酵罐 (KBT250，韩国) 中，发酵体积30 L，发酵温度 37 ℃，搅拌速度 300 r/min，空气流量15 L/min，pH 7.2，发酵时间13 h，每小时分别取样，测定 OD600及菌体干重[4]。菌体经离心后保存于−20 ℃。

1.4 碱裂解细菌

称取 400 g细菌，加入重悬液 (50 mmol/L Glucose，25 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，pH 8.0) 4 000 mL；充分重悬后在冰浴上加入裂解液(200 mmol/L NaOH，1% SDS) 4 000 mL，缓慢搅拌，形成粘稠物；随即加入中和液 (3 mol/L乙酸钾，5 mol/L CH3COOH) 4 000 mL，形成白色絮凝物，冰浴，静置1 h。用两层绸布过滤，获得碱裂解液。

1.5 超滤浓缩

选用截留分子量为 300 kDa的超滤柱 (型号003N，北京旭邦膜设备有限责任公司) 采用内压式，泵速15 r/min (BTOO-100M，兰格恒流泵有限公司)，控制浓缩液流速是超滤液流速的 2倍。超滤后最终体积为500 mL。

1.6 Sephacryl S-1000层析柱去除RNA、更换缓冲液

Sephacryl S-1000 (GE Healthcare) 填料1.5 L装于5.5 cm×80 cm层析柱中 (上海锦华层析设备厂)，溶液 A (2.0 mol/L (NH4)2SO4，100 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，pH 8.0) 平衡，碱裂解浓缩液以柱体积的 10%上样，上样结束后溶液 A洗脱，EC2000色谱工作站检测 (大连依利特分析仪器有限公司)，收集DNA峰。流速为4.5 mL/min。

1.7 Plasmidselect捕获超螺旋DNA

Plasmidselect (GE Healthcare) 填料55 mL装于2.6 cm×20 cm层析柱中 (上海锦华层析设备厂)，溶液A平衡，将Sephacryl S-1000收集的DNA溶液上样，溶液A洗脱3个柱体积，溶液 B (0.02 mol/L NaCl，2.0 mol/L (NH4)2SO4，100 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，pH 8.0) 洗脱至基线，溶液C(0.3 mol/L NaCl，1.7 mol/L (NH4)2SO4，100 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，pH 8.0) 洗脱超螺旋质粒 DNA。EC2000色谱工作站检测，收集超螺旋质粒DNA。流速为3 mL/min。

1.8 琼脂糖凝胶6BFF除盐

琼脂糖凝胶6BFF (北京韦氏博慧色谱科技有限公司) 填料300 mL装于3.5 cm×40 cm层析柱中 (上海锦华层析设备厂)，TE缓冲液[3]平衡，将收集的超螺旋质粒 DNA以不超过柱体积的 20%上样，EC2000色谱工作站检测，收集脱盐 DNA。流速4.5 mL/min。

1.9 原液制备及超螺旋比例测定

1.9.1 原液制备

量取脱盐溶液体积按1∶0.8加入异丙醇，沉淀质粒DNA，4 000 r/min离心30 min收集沉淀。沉淀用75%乙醇洗涤2次，空气干燥，按标示量配制所需浓度。

1.9.2 含量检测及超螺旋比例测定

含量检测：原液稀释125倍，利用紫外分光光度计 (Beckman DU640，USA) 检测 OD260、OD280。

超螺旋比例测定：Waters高效液相色谱仪(Waters，USA)；色谱柱：TskgelDNA-NPR (0.46 id×7.5 cm，TOSOH，日本)，检测波长：260 nm，流速0.5 mL/min，流动相 A：20 mmol/L Tris-HCl，pH 9.0；流动相 B：20 mmol/L Tris-HCl，1 mol/L NaCl，pH 9.0，进样量：5 μg，线性梯度洗脱条件：起始比例A∶B为50%∶50%，梯度洗脱30 min，最终A∶B比例为20%∶80%，35 min回到起始平衡色谱柱。

2 结果

重组质粒pUDK-HGF纯化制备流程图见图1。E. coli DH5α-pUDK-HGF在TB培养基中发酵13 h，动态观察OD600(图2)。当细菌进入稳定期后，离心收获菌体，储存于−20 ℃备用。测量菌体干重，可知在发酵11 h后菌体就进入稳定期。发酵结束后，取出 1 mL发酵液用北京三博远志质粒提取试剂盒提取质粒，测含量，发酵液中pUDK-HGF的含量约42 mg/L。

菌体按重量比 1∶10∶10∶10加入重悬液、裂解液、中和液，碱裂解液经过超滤、离心后，直接用Sephacryl S-1000除去RNA、更换缓冲液，获得质粒DNA (图3)；plasmidselect捕获超螺旋质粒DNA(图 4)，经 0.8%琼脂糖凝胶电泳分析，在电泳图上未见RNA，超螺旋DNA与开环DNA完全分离 (图5)；通过 HPLC检测，超螺旋质粒 DNA比例在99% (图 6)；plasmidselect柱捕获的含高盐超螺旋质粒DNA经琼脂糖凝胶6BFF，能达到除盐的效果(图7)。利用限制性酶对原液与标准品进行酶切鉴定[5]，结果显示原液与标准品酶切图谱一致 (图8)。

图1 重组质粒pUDK-HGF制备流程图Fig. 1 Process flow sheet for pUDK-HGF production.

图2 50 L发酵罐发酵菌体密度与干重动态曲线Fig. 2 Curve of OD and dry weight of E. coli in 50 L fermentor.

图3 Sephacryl S-1000层析分离色谱图Fig. 3 Removing RNA and exchanging buffer on Sephacryl S-1000.

图4 PlasmidSelect柱层析分离色谱图Fig. 4 Capturing the supercoiled plasmid DNA on plasmidselect. oc: open circular; sc: supercoiled.

图5 经Plasmidselect分离后质粒DNA电泳图Fig. 5 Analysis by 0.8% agarose-gel electrophoresis of purified pUDK-HGF from plasmidselect. 1: loading sample; 2: opened pUDK-HGF; 3: supercoiled pUDK-HGF; M: DNA marker.

图6 超螺旋比例HPLC分析色谱图Fig. 6 The supercoiled form of pUDK-HGF analysed by a TskgelDNA-NPR column.

图7 琼脂糖凝胶6BFF脱盐色谱图Fig. 7 Removing the salt by a sepharose 6BFF column.

图8 pUDK-HGF限制性内切酶鉴定图谱Fig. 8 Analysis by 0.8% agarose-gel electrophoresis of restriction enzyme dealing with pUDK-HGF. 1−5: sample;8−12: reference substance; 2 and 12: BamHⅠ, BagLⅡ; 3 and 11: BagLⅡ, SalⅠ; 4 and 10:EcoRⅠ, SalⅠ; 5 and 9:Hind Ⅲ ,Xba Ⅰ ; 1 and 8: plasmid pUDK-HGF; 6: λ-Hind Ⅲ Marker; 7:DNA Marker DL2 000 (2 000, 1 000, 750, 500, 250, 100 bp).

利用紫外分光光度计 (Beckman DU640，USA)检测重组质粒 pUDK-HGF原液含量及纯度，读取260 nm与280 nm处光吸收值，根据公式：样品DNA浓度 (μg/mL) =OD260×50 μg/mL×稀释倍数计算含量；OD260/OD280比值表示质粒 DNA纯度，OD260/OD280比值一般在1.75以上[2]。本工艺能获得含量为 2.0 mg/mL、OD260/OD280比值为 1.9的原液质粒DNA。

3 讨论

基因治疗可能成为一些重大疾病如肿瘤、动脉粥样硬化、骨质疏松症、关节炎等的治疗手段，而基因治疗的关键是携带治疗基因的载体能有效进入靶细胞[1]。目前，应用基因治疗的载体大致可以分为两大类，一类是病毒载体，另一类是非病毒载体。临床上腺病毒载体占 23.8%，反转录病毒载体占20.7%，质粒载体占18.3%[6]。虽然病毒载体的转染率高，但存在一些安全隐患；而质粒DNA在靶细胞中的基因表达效率低、持续时间短，但它在靶细胞中安全性高。国内重组质粒HGF用于治疗局部肢体动脉缺血疾病已进入I期临床试验。

由于色谱分离技术的高分辨率和种类的多样性，现仍在生物分离技术中占主导地位。迄今为止，已有大量的色谱分离技术应用于质粒DNA的分离纯化，例如：阴离子交换色谱 (Anion exchange，AE)[7]、亲和层析色谱 (Affinity chromatography，AC)[8]、疏水交换色谱 (Hydrophobic interaction chromatography，HIC)[9]、反相色谱 (Reverse phase，RP)[10]、排阻色谱 (Size exclusion，SE)[11]。虽然色谱填料价格昂贵，但具有容易放大的优点，适用于工业化生产质粒DNA。

碱裂解细胞是纯化过程的关键步骤，碱裂解不当会使超螺旋质粒DNA断裂，开环质粒DNA含量增加；在加入碱裂解液时，要缓慢搅拌均匀，否则会导致局部过碱，造成超螺旋DNA的断裂；随后中和液用量也比较关键，用量过多，使溶液偏酸性，超螺旋质粒DNA会发生断裂；用量过少，碱裂解液中和不充分，宿主蛋白、DNA不能完全沉淀，后续纯化难度加大。

利用超滤柱对碱裂解液进行浓缩，泵速和液体在管道内的运动形式是控制超螺旋质粒 DNA比例的关键。若泵速过高，流体在管道内易形成湍流，剪切力较大，易造成超螺旋质粒DNA大量断裂；适当控制泵速是超滤浓缩的关键，本工艺控制转速在15 r/min以下可以获得超螺旋比例高的质粒DNA浓缩液。

Plasmidselect捕获超螺旋质粒DNA，硫酸铵的离子浓度会影响超螺旋和开环质粒 DNA与plasmidselect的结合能力。硫酸铵浓度低于2.0 mol/L，则超螺旋和开环质粒 DNA均不与 plasmidselect结合；硫酸铵浓度高于2.0 mol/L，则超螺旋与开环质粒DNA均与plasmidselect结合，一方面影响填料对超螺旋质粒DNA的负载量，另一方面影响超螺旋质粒DNA的比例。

Zhang等[2]之前建立的工艺与文中建立的工艺相比，在同等规模下处理碱裂解液，使用的层析填料用量多，生产周期较长。新工艺的建立应用超滤柱对碱裂解液进行浓缩，缩短生产周期，降低生产成本；同时，plasmidselect对超螺旋质粒DNA是特异性吸附，吸附量可达到0.4 mg/mL及以上，获得的质粒DNA超螺旋比例高。通过本试验可知，选用截留分子量为300 kDa的超滤柱可有效地浓缩质粒DNA。应用于大规模生产时，浓缩获得高浓度超螺旋质粒DNA，可以避免用异丙醇或乙醇沉淀质粒时造成大量质粒损失。

REFERENCES

[1] Zhang QL, Li MY, Wu ZZ. Research advance of gene therapy for peripheral arterial disease using hepatocyte growth factor. Chin J Rep Recons Surg, 2006, 20(11):1147−1150.

张庆林, 李敏元, 吴祖泽. 肝细胞生长因子基因治疗周围动脉闭塞症研究进展. 中国修复重建外科杂志, 2006,20(11): 1147−1150.

[2] Zhang QL, Bi JJ, Xiao FJ, et al. Production of plasmid DNA encoding human hepatocyte growth factor for gene therapy. Biotechnol Appl Biochem, 2008, 49(Pt 1): 11−16.

[3] Lu SD. Current Protocols for Molecular Biology. Beijing:Higher Education Press, 1993: 571−594.

卢圣栋主编. 现代分子生物学实验技术. 北京: 高等教育出版社, 1993: 571−594.

[4] Bi JJ, Zhang QL, Wei HD, et al. Effect of growth medium on the yield of recombinant plasmid pcDNA3-HGF. Lett Biotech, 2000, 11(4): 271−274.

毕建进, 张庆林, 魏汉东, 等. 培养基对重组质粒pcDNA3-HGF产率的影响. 生物技术通讯, 2000, 11(4):271−274.

[5] Zhang QL, Xiao FJ, Bi JJ, et al. Quality analysis of recombinant plasmid pUDKH. Lett Biotech, 2006, 17(5):733−736.

张庆林, 肖凤君, 毕建进, 等. 重组质粒pUDKH的质量分析. 生物技术通讯, 2006, 17(5): 733−736.

[6] Journal of gene medicine. Vectors used in gene therapy clinical trials [EB/OL]. [2009-12-20]. www.wiley.com/legacy/wileychi/genmed/clinical.

[7] Przybylowski M, Bartido S, Borquez-Ojeda O, et al.Production of clinical-grade plasmid DNA for human phase Ⅰ clinical trials and large animal clinical studies.Vaccine, 2007, 25(27): 5013−5024.

[8] Cano T, Murphy JC, Fox GE, et al. Separation of genomic DNA from plasmid DNA by selective renaturation with immobilized metal affinity capture. Biotechnol Prog,2005, 21(5): 1472−1477.

[9] Diogo MM, Queiroz JA, Monteiro GA, et al. Purification of a cystic fibrosis plasmid vector for gene therapy using hydrophobic interaction chromatography. Biotechnol Bioeng, 2000, 68(5): 576−583.

[10] Ferreira GNM. Chromatographic approaches in the purification of plasmid DNA for therapy and vaccination.Chem Engine Technol, 2005, 28(11): 1285−1294.

[11] Urthaler J, Buchinger W, Necina R. Improve downstream process for the production of plasmid DNA for gene therapy. Acta Biochim Pol, 2005, 52(3):703−711.

Pilot-scale production of recombinant plasmid pUDK-HGF

Chunsheng Hu1,2, Yanliang Wang1, Yuxin Lu1, Xiaochen Cheng1, Lin Liu1, Tong Zhang2,and Qinglin Zhang1
1 Beijing Institute of Radiation Medicine, Beijing 100850, China
2 College of Chemical Engineering, Inner Mongolia University of Technology, Hohhot 010051, China

Received: May 5, 2010; Accepted: July 29, 2010

Supported by: Major Special Projects in National Science and Technology Pillar Program during the Eleventh Five-Year Plan Period(No. 2008ZX10004-015).

Corresponding author: Chengfeng Qin. Tel: +86-10-66948604; Fax: +86-10-63898239; E-mail: cfqin@hotmail.com

国家“十一五”重大科技专项课题 (No. 2008ZX10004-015) 资助。