毛茛皂苷的提取及其抑菌作用初步分析

苏 波

(长沙外国语学校,湖南长沙 410001)

毛茛皂苷的提取及其抑菌作用初步分析

苏 波

(长沙外国语学校,湖南长沙 410001)

采用D-101大孔树脂吸附和正丁醇萃取两种不同的方法对毛茛皂苷进行提取分离,对分离纯化后的样品采用紫外可见光全波长扫描分析和高效液相色谱纯度和含量鉴定1结果表明分离纯化后的毛茛皂苷在209 nm处有最大吸收峰,正丁醇萃取的毛莨皂苷含量比大孔树脂吸附分离的较高.以毛茛皂苷对9种不同细菌进行抑菌实验,显示毛茛皂苷对绿脓杆菌、粪肠球菌、产气肠球菌、金黄色葡萄球菌均具有较明显的抑菌作用.

毛茛皂苷; 大孔树脂吸附; 正丁醇萃取; 抑菌作用

毛茛(Ranunculus japonicusThunb)是毛茛科(Ranunculaceae)毛茛属(Ranunculus)植物,以带根全草入药,又名老虎脚迹、五虎草等.生于田沟旁和林缘路边的湿草地上,除西藏外,在我国各省区广布1味辛,性温,有毒.具有利湿、消肿、止痛、退豁、截疟、杀虫之功效,中医临床用于主治疟疾、黄疽、偏头痛、胃痛、风湿关节痛、鹤膝风、痈肿、恶疮、疥癣、牙痛、火眼等疾病.毛茛始载于《本草拾遗》,在《本草纲目》中也有记载,应用历史悠久[2]1

毛茛种类多,在我国分布广,其药用价值逐渐得到重视,迄今为止,国已内相继从毛茛中分离得到了20个化合物.近年来对毛茛的研究表明其具有抗菌杀菌、抗组胺、抗肿瘤、松弛血管或子宫平滑肌以及在农业方面具有杀灭病虫害等作用[1]1皂苷广泛分布于自然界,包括三萜皂苷和甾体皂苷,因水溶液振摇后可生成胶体溶液,并有持久性似肥皂溶液的泡沫而得名[2].药理研究证明,皂苷具有抗炎、抗肿瘤、抗菌和抗病毒、降低胆固醇、降血糖和免疫调节等多方面的生物活性和药理作用[3].由于毛茛皂苷提取物往往被认为有效成分含量低、杂质多、质量不稳定,用药多建立在经验的基础上,难以与现代医学接轨1为解决这个问题,研究并优化毛茛皂苷的提取与纯化工艺十分必要.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 材料采集与处理

本研究所用材料于2009年7-9月份采自当地田野、道旁,经专家鉴定为毛茛(Ranunculus japonicus Thunb)1毛茛采回后用自来水洗净,去根,置于阴凉通风处自然干燥,然后用DS—1组织粉碎机粉碎,40目筛子过筛并保藏待用1

1.1.2 供试菌种及试剂

供试大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌、粪肠球菌、产气肠杆菌、副甲硫杆菌、鸡沙门氏菌9菌种均来自于湖南师范大学;实验药品均为国产试剂1

1.2 实验方法

1.2.1 毛茛粗提物制备

精密称取50 g毛茛粉末两份(分别用于正丁醇萃取和树脂吸附制备皂苷),分别加500 ml 70%乙醇浸泡24小时后超声波辅助提取(超声波条件t=45 min,T =30℃,W=750 w,超声间隙2 s),然后用四层纱布过虑.将滤渣再加500 ml 70%乙醇重复此操作,合并提取液1将提取液抽滤后,旋转蒸发(130 pa,60℃)浓缩,得到毛茛粗提液.将粗提液先用等体积的石油醚萃取1-2次,再用等体积的乙酸乙酯萃取4-5次,直至上层(乙酸乙酯)为浅绿色,留下层液待用(待用液).

1.2.2 毛茛皂苷的制备

[2]中皂苷的提取,将以上待用液用等体积的正丁醇萃取2-3次,合并萃取液后低温旋转蒸发得到浸膏,加20 ml蒸馏水溶解得到棕红色水溶液,其浓度为215 g/ml1

将用5%NaOH处理好的D-101大孔树脂装填层析柱后,按文献[4]方法进行毛茛皂苷的分离提取.将三次乙醇洗脱液合并后低温旋转蒸发浓缩至20 ml,得到棕红色液体,其浓度为215 g/ml.

1.2.3 毛茛皂苷的鉴定与分析

采用泡沫试验法鉴定毛茛皂苷[2]1

将上述制备得到的棕红色液体(皂苷溶液)稀释100倍,在波长为200～800 nm下紫外全程扫描,记录其最大吸收峰的波长1以此最大吸收峰的波长为检测波长进行高效液相色谱分析.用HNTX-Ⅲ为内标.

1.2.4 抑菌实验

采用牛肉膏蛋白胨培养基培养9种供试细菌,将每一菌种均同时划线接种于一个斜面培养基和两个平板固体培养基上,37℃恒温培养24 h1用药敏纸片扩散法[5]对有效菌株的筛选,测定抑菌圈直径;采用二倍稀释法[6]测最低抑菌浓度(MIC)1

2 结果

2.1 毛茛皂苷的鉴定

经正丁萃取和经大孔树脂吸附所得的棕红色液体加热煮沸约10 min后过滤于一试管中,剧烈振荡,产生大量泡沫并长时间不消失(大于30 min),说明该液体含有高浓度皂苷.

2.2 毛茛皂苷的提取分析

对提取得到的毛茛皂苷在200～800 nm下紫外全程扫描显示,其最大紫外吸收波长为209 nm(图1).

经HPLC分析,内标HNTX-III和毛茛皂苷的HPLC各峰保留时间与各峰面积分别见图2与图3,其量化数据如表1所示.

图1 毛茛皂苷的紫外扫描图谱

图2 内标和毛茛皂苷的HPLC峰保留时间图谱

图3 内标和毛茛皂苷的HPLC峰面积图谱

从图2、3与表1可见,正丁醇萃取的毛茛皂苷粗品比树脂吸附分离得到的毛茛皂苷粗品的成分要复杂,前者共有10个明显的保留峰.根据各峰的保留时间,初步可推断树脂吸附分离得到的毛茛皂苷粗品HPLC中的1、2、3、4、5、6号分别对应正丁醇萃取的毛茛皂苷粗品HPLC中的1、2、5、8、9、10号峰,说明正丁醇萃取的毛茛皂苷粗品中还存在其他4种不同的杂质成分1根据峰面积大小基本判断1号峰为毛茛皂苷的保留峰(主峰),正丁醇萃取的毛茛皂苷粗品和树脂吸附分离得到的毛茛皂苷粗品的HPLC中1号峰与内标峰的保留时间相近,且与内标1号峰的相对面积之比分别为0.1961和0.8789,可见正丁醇萃取毛茛皂苷收获率是树脂吸附分离毛茛皂苷收获率的4148倍,且与毛茛皂苷粗品中其他成分比较,正丁醇萃取毛茛皂苷的纯度整体大于树脂吸附分离毛茛皂苷的纯度.

表1 HPLC图谱分析数据

2.3 毛茛皂苷的抑菌能力分析

利用HPLC对正丁醇萃取的毛茛皂苷粗品进行多次纯化得到较纯净的毛茛皂苷用作抑菌试验1在选取的九种菌株中,毛茛皂苷对绿脓杆菌、粪肠球菌、产气肠球菌、金黄色葡萄球菌有明显的抑菌作用,测得其平均抑菌圈的大小与空白对照的比值分别为215、210、117、115(表2),而对其他5种细菌没有明显的抑制生长的效果.由此可知毛茛皂苷对绿脓杆菌抑制能力最大,其次分别是产气肠球菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌.其中绿脓杆菌和产气肠杆菌均为革兰氏阴性菌,所以毛茛皂苷可能对革兰氏阴性菌的抑制力大于对革兰氏阳性菌的抑制作用.

通过二倍稀释法测定了毛茛皂苷对筛选的4种有效菌株的最低抑菌浓度(MIC),实验结果表明,毛茛皂苷对粪肠球菌和金黄色葡萄球菌的MIC均为62.50 mg/ml,而对其他2种细菌的MIC都为31.25 mg/ml(表2).同样可证明毛茛皂苷对绿脓杆菌和产气肠杆菌生长的抑制作用比对粪肠球菌和金黄色葡萄球菌生长的抑制作用要强.

表2 毛茛皂苷的抑菌效果

3 讨 论

通过用正丁醇萃取法和大孔树脂吸附分离法对毛茛皂苷提取含量和纯度进行综合比较,尽管大孔树脂吸附分离法得到的毛茛皂苷样品含杂质较少,但毛茛皂苷的相对含量不高,按HPLC峰面积计算,毛茛皂苷的峰面积与其他杂质总峰面积比为1.243(1079558/ 868502);相反,正丁醇萃取法得到的毛茛皂苷样品含杂质成分个数虽然较多些,但毛茛皂苷的相对含量明显较前者高,其与其他杂质总峰面积比为2.997 (4839328/1614965)1因此,正丁醇萃取对毛茛皂苷的提取率明显高于大孔树脂吸附的分离.而且,结合HPLC的多次纯化,单位数量的原材料毛茛中可更多地收获到较高纯度的毛茛皂苷.然而,正丁醇萃取法需要耗费较多的剂试,提取成本较,且对环境有一定的污染.因而,如何更加有效地获取毛茛皂苷还需更近一步研究.

抑菌结果显示毛茛皂苷对绿脓杆菌、粪肠球菌、产气肠球菌、金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用,而对其他5种菌株没有明显的生长抑制性,说明其缺乏广谱抑菌作用.然而,它对绿脓杆菌和产气肠球菌的MIC都仅为31.25 mg/ml,明显小于其他植物成分抑菌的MIC[6-8],表明它对绿脓杆菌和产气肠球菌生长可能存在较特异的抑制作用,为其药理药学开发起到一定的提示作用1

参考文献:

[1]王榕乐,谭毓治.毛茛总苷对血管紧张素Ⅱ致心肌肥大的影响[J].广东药学院学报,2008,24(2):154-156.

[2]陈晓青,蒋新宇,刘佳佳.中草药成分分离分析技术与方法[J].北京:化学工业出版社,2006:180-202.

[3]蔡飒,李校坤.用血清药理学方法观察毛茛提取液对家兔主动脉平滑肌细胞内钙的影响[J].中药材,2004, 27(10):741-744.

[4]刘敏彦,王玉峰,叶晓红.HPD300型大孔吸附树脂分离纯化白芍总苷的工艺研究[J].中国医学杂志,2010, 30(3):201-204.

[5]National Committee for Clinical Laboratory Standards:Dilution antimicrobial susceptibility tests forbacteria thatgrow aerobically [J].Approved Standard:NCCLS document,1993:M7-A3.

[6]刘胜贵,陈鸠鸠,李军,等.羊耳菊有机溶剂提取物的抑菌作用研究[J].辽宁中医杂志,2010,37(3):398 -400.

[7]刘胜贵,彭斯文,闵丹.18种抗炎症中草药的抑菌作用研究[J].现代中医药,2007,27(2):41-43,70.

[8]樊明涛,陈锦屏.百里香提取物抑菌特性的研究[J].微生物学报,2001,41(4),499-504.

Abstract:Saponin was extracted and purified by D-101 macroporous resin adsorption and n-buoh alcohol extraction fromRnauneuusl.And saponin was analyzed through Uv,which indicate that its maximum absorption wavelength is 209 nm.As the same time,the purity and content of saponin which obtained by two different methods were tested by HPLC.The results showed that the effect of n-butyl alcohol extraction is better than that of the macroporous resin adsorbent.Then,the saponin was to be examined its preliminary bacteriostasis abilityon 9 different bacteria by measuring the size of the circle of bacteriostasis,the results showed thatsaponinhas the obviousbacteriostaticaction onBacillussubtilis,P.aeruginosa,E.faecalis,Gasaureus Staphyloccocus aureus Rosenbach.

Key words:saponin of Ranunculus japonicus; macroporous resin adsorption; n-butyl alcohol extraction; bacteriostasi

A Research on the Extraction of Saponin fromRnauneuusl and Its Preliminary Bacteria Functions

SU Bo
(School of Foreign Languages in Changsha,Changsha,Hunan 410001)

R284

A

1671-9743(2011)02-0053-04

2011-02-11

苏 波(1969-),男,湖南岳阳人,湖南农业大学硕士生,主要研究环境生物学.