大鼠脑弥漫性轴索损伤后早期病理学的研究

陈仁辉

(福建警察学院刑事科学技术系,福建福州 350007)

大鼠脑弥漫性轴索损伤后早期病理学的研究

陈仁辉

(福建警察学院刑事科学技术系,福建福州 350007)

目的:探讨大鼠脑弥漫性轴索损伤(DAI)后早期轴索病理学改变及c-Fos蛋白的变化,为DAI的早期法医病理学鉴定寻找新的依据1方法:参照Marmarou的打击负荷伤模型,建立大鼠DAI动物模型1运用神经纤维特殊染色法观察轴索的病理学改变,并运用免疫组化SABC法观察c-Fos的变化1结果:嗜银染色于打击后1 h即可观察到部分神经纤维不规则增粗、肿胀、少数断裂,6 h观察到轴突断端球形改变,24 h可见典型轴索收缩球1打击后15 min时,即可观察到c-Fos的表达,3 h达到高峰,24 h后仍可见一定量表达,表达呈弥漫性,以胼胝体、脑干最为明显1对照组未见阳性反应1结论:嗜银染色可以很好的观察DAI后轴索的病理学改变1c-Fos是脑弥漫性轴索损伤的灵敏指标,对于早期DAI的诊断具有一定的应用价值.

弥漫性轴索损伤; 嗜银染色; c-Fos; 免疫组织化学

弥漫性轴索损伤(diffuse axonal injury1DAI)是颅脑损伤的一种重要形式,它在重型闭合性颅脑损伤中占20%1DAI可以导致颅脑损伤患者死亡(死亡率高达42%～62%[1])、植物生存或严重的神经功能障碍,是外伤性脑损伤中最严重的损伤之一1DAI由于缺乏特异性的神经定位体征以及影象学改变,其最终诊断需要通过组织病理学,但是早期的DAI往往没有典型的病理学改变,所以如何鉴定早期的DAI是法医病理学工作者面临的一大难题.

本研究拟通过建立大鼠DAI动物模型,运用神经纤维特殊染色法观察不同时间、不同部位轴突的病理学改变1并对其不同时间、不同部位脑损伤后c-Fos表达的变化进行观察,期望能为DAI早期法医学鉴定提供客观的病理形态学依据.

1 材料与方法

1.1 动物分组 健康雄性SD大鼠48只(南京青龙山实验动物中心提供),体重300～350 g,随机分成DAI 15 min、30 min、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h组及对照组,共8组1每组6只大鼠.

1.2 DAI动物模型制作 采用Marmarou脑损伤模型[2],用1%戊巴比妥钠腹腔注射(30 mg/kg),麻醉成功后,大鼠头部做中线切口,暴露颅骨,将直径10 mm、厚3 mm的打击垫片用高分子聚脂固定于颅顶的冠状缝与人字缝之间的中央部,然后将大鼠俯卧固定

已知厚度及弹性系数的海绵床上,待动物开始苏醒,有肢体活动时,移至有机塑料管下端,垫片正对管中央1450 g铁棒从2 m高度自管内自由坠落至打击垫片上,立即移开海绵床以免二次损伤1在设定的时间内将动物过量麻醉后,断头取脑.

1.3 组织及切片处理 打开颅骨后迅速用4%多聚甲醛液预固定,取出大鼠全脑于4%多聚甲醛液后固定12 h,沿大脑正中裂矢状切开大脑、小脑、脑干,于正中切面左右外侧3 mm处切取左右大脑皮质、胼胝体、丘脑以及脑干组织各一块,分别做常规石蜡包埋1切片厚5 um,分别作HE染色、嗜银染色及c-Fos免疫组织化学染色.

1.4 试剂及方法 硝酸银、氯化金、硫代硫酸钠、饱和氨水,按G lees-Marslands染色法[3]进行1Rabbit Anti -C-FOS(北京金山公司);DAB显色试剂盒及SABC试剂盒(武汉博士德公司),按说明书进行操作1用PBS取代一抗、二抗作阴性对照,以细胞核/浆出现黄色产物为阳性结果.

2 结果

2.1 动物观察

动物受到打击后,出现即刻的呼吸暂停数秒,随即进入持续昏迷状态,有的动物在昏迷期间偶伴抽搐1所有的动物表现为竖毛,少数动物出现尿失禁、全身痉挛、四肢强直15只动物(约10%)于打击后数分钟

呼吸停止,死亡1动物清醒后表现为活动减少,部分出现肢体活动受限1对照组动物无明显变化.

2.2 HE染色

实验组可见蛛网膜下腔出血,少数动物可见脑干有淤斑性出血、侧脑室出血1未见脑组织局灶性病灶1神经元胞体明显肿胀,结构不清,核固缩,胞浆红染加深,神经元损害主要分布于两侧大脑皮质1胶质细胞肿胀明显1细胞周围间质水肿.

2.3 嗜银染色

打击后1 h即可观察到部分神经纤维不规则增粗、肿胀、少数断裂(图1),6 h神经纤维明显增粗、肿胀并呈串珠状、波浪状或螺旋状改变,断端膨大呈球形(图2),12 h收缩球较为明显,24 h可见典型轴索收缩球,且数量增多(图3).

图1 脑损伤后1 h,少数神经纤维不规则增粗 嗜银染色×400

图2 脑损伤后6 h,神经纤维明显增粗,呈波浪状改变 嗜银染色×400

图3 脑损伤后24 h,神经纤维断端球形改变 嗜银染色×400

图4 脑损伤后15 min,c-Fos阳性反应细胞,散在少量分布 SABC×200

2.4 c-Fos免疫组织化学染色

打击后15 min,即可观察到c-Fos阳性反应细胞,呈散在少量分布(图4).阳性产物呈棕黄色,主要位于胞核内,胞浆内以及大的突起根部也有表达(图5). 1 h后表达明显增加,并于3 h达到高峰(图6).随着时间延长,c-Fos阳性反应细胞逐渐减少,24 h可见少量表达.表达以皮层、脑干最为明显,阳性反应细胞包括神经元及各类胶质细胞.正常对照组未见c-Fos阳性反应细胞.

图5 脑损伤后,c-Fos阳性反应产物在胞核、胞浆以及大的突起根部表达 SABC×200

图6 脑损伤后3 h,c-Fos阳性反应细胞明显增加 SABC×200

3 讨论

弥漫性轴索损伤(diffuse axonal injury1DAI)是一种特殊类型的脑损伤,它是从病理学角度提出的概念,其发现至今已有数十年的时间.嗜银染色是显示神经轴突的传统方法,可用于观察轴突在损伤后的病理改变,如弯曲、肿胀、断裂及回缩球形成等.有研究发现[4],神经轴突在伤后1～2 h,轴索变粗,进而肿胀呈串珠状、波浪状或螺旋状改变,伤后12 h以上,出现典型轴索收缩球.本研究发现DAI后1 h即可观察到部分神经纤维不规则增粗、肿胀、少数断裂,6 h断端膨大呈球形,12 h收缩球较为明显,24 h可见典型轴索收缩球1这与文献报道基本一致.嗜银染色可以较早、较好的观察轴索的病理学改变.

近年来,随着对DAI研究的不断深入,发现外力除引起原发性轴索损伤(primary axonal injury)外,更多的是导致非中断性轴索损伤(nondisruptive axonal injury)[5],即轴索在受伤当时并不出现断裂,而是随病程发展,轴索逐渐出现继发性病理改变,最终于伤后数小时才发生轴索中断,即继发性轴索断裂(secondary axonal injury)1非中断性轴索损伤后至延迟性轴索断裂及轴缩球的形成,这期间是一个复杂的病理生理学过程1c-Fos是c-fos基因激活后转录生成的mRNA编码的核蛋白1当神经组织受到病理性刺激如脑缺血、癫痫和外伤等作用时,c-fos基因快速表达[6,7],因此被称为快速反应原癌基因(pro-oncogene),属于即早基因家族(immediate early gene,IEGS).c-fos基因被激活后通过fos/jun二聚体,构成活化蛋白-1(AP-1)转录因子调控下游基因的表达[8],所以在中枢神经系统对创伤的初始应答与继发性病理生理改变之间c-fos基因的激活可能成为重要的中介.本研究发现打击后15 min,即可观察到c-Fos阳性反应细胞,1 h后表达明显增加,并于3 h达到高峰,24 h后可见少量表达.c -fos基因的早期表达是对外界损伤性刺激直接而快速的反应,它的中介作用可能启动了继发性轴索断裂.

Smeyne等[9]学者认为c-fos过度表达似乎是细胞终末分化的标志及死亡先兆,且先于细胞出现生化和死亡形态学改变数小时至数天.c-fos基因表达是神经组织受伤害的早期指标.本研究发现在嗜银染色尚未检见DAI病理改变时,c-Fos就有表达,c-Fos是DAI的灵敏指标,当然由于神经组织受到其他病理性刺激如脑缺血、癫痫等作用时也有表达,所以c-Fos用于DAI的早期诊断时需要结合大体及病史1我们认为c-Fos对于早期DAI的诊断具有一定的应用价值1参考文献:

[1]Bennett MO,Brien DP,Philips JP,et al.Clinicopathologic observation in 100 consecutive patients with fatal head injury admitted to a neurosurgical unit[J].Ir Med J,1995,88: 60-69.

[2]Foda MA,Marmarou A.A new model of diffuse brain injury in rats.Part II:Morphological characterization[J].Neurosurg, 1994 Feb;80(2):301-313.

[3]孔庆雷译.组织病理学与组织化学技术手册(第1版) [M].北京:科学出版社,1982,445-446.

[4]AdamsJ N,Poveishocks.Diffuse axonal injury in head injury, definition,diagnosis and grading[J].Histopathol,1989, 15:49-54.

[5]PovlishockJT,ChristmanCW.Thepathobiologyof traumatically induced axonal injury in animals and humans:a review of current thoughts[J].Neurotrauma,1995,12 (3):555-564.

[6]G iza CC,Prins ML,Hovda DA,et al.Genes prefereutially induced by depolarization after concussive brain injury:effects of age and injury severity[J].Neurotrauma,2002,19(4): 387-395.

[7]Morgan S,Greenberg ME.The regulation andfuction of c-fos and other IEGS in the neurous system[J].Neuron,1990,4 (2):477-487.

[8]Kaminska B,Kaczmarek L.Robust induction of AP-1 transcription factor DNA binding activity in the hippocampus of aged rats[J].Neurosci Lett,1993,153:189-191.

[9]Smeyne RJ,Vendrell M,Hayward M et al.Continous c-fos expression precedes programmed celldeath in vivo[J]. Nature,1993,363(1):166-174.

Abstract:Objective:T o explore the changes of c-Fos in early stage of diffuse axonal injury(DAI)in rats so as to find a new evidence for early forensic pathologic diagnosis of DAI.Methods:Based on Marmarou's impact/compression trauma model, the rat model of DAIwas established.ImmunohistochemicalSABC method was used to observe the expressionof c-Fos,combining special stainingof neurol fibers to observe the changesof axons.Results:It wasfound that swollen and ruptured axon in brain stem at 1h,marked swelling of the axonal severe end at 6 h,axonal retraction ball at 24 h by silver staining after DAI.The expression of c-Fos could be detected at 15 min after injury,peaked at 3 h.The expression of c-Fos was found in wide range but significant in callus and brain stem.The control group showed negative staining.Conclusion:Silver staining is a good way to observe the changes of axons.c-Fos is a sensitive index to DAI and is helpful to diagnose early DAI.

Key words:diffuse axonal injury; silver staining; c-Fos; immunohistochemistry

A Study on Pathologic Changes in Early Stage of Diffuse Axonal Injury in Rats

CHEN Ren-hui
(Department of Criminal Sciences and Technology,Fujian Police Institute,Fuzhou,Fujian 350007)

Q956

A

1671-9743(2011)02-0048-05

2010-12-01

福建省教育厅资助,课题编号:JA071901

陈仁辉(1979-),男,安徽宁国人,福建警察学院讲师,硕士,主要从事闭合性颅脑损伤的分子病理学研究.