1株抑制土传病原菌且产纤维素酶芽胞杆菌筛选及产酶条件的研究

刘晓辉，陈顺，陈飞，王红旗，桓明辉，高晓梅，张岩，于广峰，孙立梅，郭玲玲

(辽宁省微生物科学研究院，辽宁朝阳122000 )

1株抑制土传病原菌且产纤维素酶芽胞杆菌筛选及产酶条件的研究

刘晓辉，陈顺，陈飞，王红旗，桓明辉，高晓梅，张岩，于广峰，孙立梅，郭玲玲

(辽宁省微生物科学研究院，辽宁朝阳122000 )

通过刚果红染色法和DNS分光光度法对6种芽胞杆菌分泌胞外纤维素酶进行筛选，再通过管碟法测试对5种病原菌的抑菌作用，得到1株芽胞杆菌(菌株编号为X-02)酶活达182.5 U/mL，而且对几种土传病害有抑制作用。并对其产酶发酵培养基碳源、氮源及初始pH、发酵温度、接种量、摇瓶转速和时间进行优化，结果显示该菌株最佳碳源是2%CMC-Na，其次是葡萄糖，二者产酶之差只为21 U/mL。考虑大量生产的成本和方便性(CMC-Na溶解慢)，选择葡萄糖为碳源，氮源为2.0%蛋白胨与酵母膏复合氮源，在pH值为8.0、温度37℃、接种量为2%、转速为180 r/min、时间48 h条件下酶活达到391.0 U/mL酶液，比优化前提高了2.1倍。

纤维素酶;芽胞杆菌;发酵;管碟法;病原菌

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种选育芽胞杆菌6株，菌种编号分别为X-01、X-02、X-03、X-04、X-05、X-06，均由本实验室分离保存。

1.1.2 培养基①羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基(%):CMC-Na 1，蛋白胨0.5，酵母膏0.05，KH2PO40.15，MgSO40.02，NaCl 0.5，琼脂1.5，pH 7.2～7.4;②种子培养基(%):葡萄糖2.0，酵母膏1.0，蛋白胨1.0，NaCl 0.5，KH2PO40.1，pH 7.0～7.5。

1.1.3 主要试剂和溶液DNS显色液，底物溶液，标准葡萄糖溶液，CMC-Na。

1.2 方法

1.2.1 纤维素酶活力测定①初筛(染色法):将活化的芽胞杆菌液用滴种法滴种在CMC-Na平皿上，培养2～4 d，0.2%刚果红染色30 min，依次用蒸馏水和浓度为1 mol/L的NaCl彻底洗去染液，再用5%的醋酸液固定颜色。在菌落周围形成深红色染色圈证明此菌分泌纤维素酶。用游标卡尺分别测量染色圈直径和菌落直径，根据两者比值大小初步确定纤维素酶活性的高低;②复筛:用DNS法测酶活力。取3支20.0 mL试管，1支做空白对照，其余2支做平行样品管。样品管中加1.0 mL原样酶液，然后3支试管中分别加入4.0 mL已预热至60℃的底物溶液，在60℃水浴中准确计时20 min取出，每管立即加入1.0 mL 2.0 mol/L氢氧化钠溶液和2.0 mL DNS显色液，摇匀后在对照管中再加入1.0 mL原样酶液，将3支试管置于沸水浴，准确计时显色5 min取出，流水迅速冷却，并用蒸馏水定容至20.0 mL，摇匀后用分光光度计在490 nm处测定吸光度值。在上述条件下，每分钟产生1 μg葡萄糖的酶量定义为一个酶活单位。

对协方差Pk同步进行调整，把位置x,y,z有关的矩阵元素调整到前t行前t列，即矩阵的左上角。针对目标跟踪应用场景，t=3。

纤维素酶活计算:U=M1－M0/20

U—样品的酶活力，单位为μg/min

M0—对照葡萄糖量，单位为μg

M1—分解后样品质量，单位为μg

20—酶与底物反应时间。单位为min

1.2.2 发酵条件的初步优化对上述筛选到的产酶活力最高菌株在发酵培养基碳源、氮源、接种量、初始pH值、发酵温度、发酵时间和摇瓶转速上进行优化，以提高目的菌的产酶活力，酶活测定方法同DNS法。

1.2.3 X-02对5种土传病病原菌的抑菌作用

①芽胞杆菌发酵液制取:将X-02菌种活化后接种于种子培养基中，37℃培养12 h，然后以2%的接种量接种于发酵培养基中，180 r/min，37℃，发酵48 h，过滤得到滤液备用;②5种土传病害病原菌菌悬液的制备:将立枯丝核菌、黄瓜枯萎、韭菜根腐、番茄早疫和辣椒菌核5种病原菌接于准备好的无菌PDA试管中，28℃培养5 d，把培养好的菌种转到带有玻璃珠的无菌水中，充分振动10 min，备用。用管碟法测定。

2 结果

2.1 初筛结果

将各菌株分别在CMC-Na平板上以3点滴种，经培养、染色后，6株在菌落周围产生大小不等的水解圈，初步确定能产纤维素酶。通过对比H/C比值(测量透明圈直径H和菌落直径C之比)，初步确定纤维素酶活力的大小，见表1。虽然透明圈的大小直接反映了酶浓度的高低，但不能完全代表菌株产酶能力，其原因是多方面的。不同菌株具有不同的生长和产酶速度及不同的纤维素酶系，菌苔大小及在平板上堆积情况的差异等都会造成透明圈大小不同，又固体和液体培养基条件不同，所以液体发酵复筛必不可少。

2.2 酶活力测定结果

将初筛有染色圈的菌株进一步经摇瓶发酵复筛证明，在检测平板上，多数产生较大红色水解圈的菌株，其发酵液中酶活力也较高。由表2得出菌株X-02酶活力最高，达182.5 U/mL。不同芽胞杆菌菌株在不同的发酵条件下测定的纤维素酶活力之间存在着很大的差异，原因是酶的合成受很多因素的影响:首先酶合成受菌体生长速率影响较大，其次酶合成还与诱导物的诱导作用及能量代谢有关。

表1 刚果红染色法实验结果Table 1The result of congo red dying methcd

表2 不同芽胞杆菌纤维素酶活力测定结果Table 2Determination of enzyme activing of different bacilli

2.3 发酵条件的初步优化

2.3.1 接种量对X-02产酶的影响采用液体培养基，接种量分别为1%、2%、3%、4%、5%，培养48 h后测纤维素酶酶活力，结果见图1。由图1可知，接种量为2%时，菌体浓度相对其他接种量较小，但由酶活测定结果可见接种量为2%时培养液中酶活力最高，高于或低于2%接种量酶活力均减少，故最佳接种量为2%。

2.3.2 碳源对X-02产酶的影响改变基础培养基中碳源的种类和浓度，37℃培养48 h，结果见表3。由表3可见，X-02对碳源利用广泛，在以糖类物质为碳源的培养基中生长较好，且酶活也较高，在淀粉、麸皮中酶活也较高，但对于X-02产生纤维素酶的最佳碳源是CMC-Na，并且以2%浓度的CMC-Na为唯一碳源为最佳。考虑生产成本和使用方便性(CMC-Na溶解较难)，生产时碳源选择葡萄糖。

2.3.3 氮源对X-02产酶的影响改变基础培养基中氮源的种类和浓度，37℃培养48 h，测定酶活力，结果见表3。表3表明，X-02几乎不能利用无机氮源，在无机氮源的培养基中几乎不能生长，酶活也很低。其他受试氮源均可作为X-02生长和产酶的氮源，其中以2.0%蛋白胨、酵母膏复合氮源为最优。在此复合氮源液体培养基中，X-02生长好，酶活也最高，其酶活可达288.0 U/mL。

表3 不同碳源、氮源对产酶的影响Table 3Effect of various carbrn、nitrogen sources on enzyme formation

2.3.4 培养基初始pH值对产酶的影响将芽胞杆菌X-02分别接种于不同初始pH值(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)的发酵培养基中，按同样的发酵条件发酵，对产酶情况进行对比，结果见图2。图2表明，该菌在pH值为8.0～9.0范围内酶活力较高，pH值为8.0时酶活力达到288.1 U/mL，pH值大于9.0后开始呈下降趋势，故确定发酵培养基的初始pH值为8.0。培养基初始pH值对芽胞杆菌分泌纤维素酶活力影响不同，一方面由于菌种的来源不同，其生长繁殖所要求的pH值也不同另一方面与发酵时间有关，发酵时间过长造成培养基pH值变化较大，对酶的稳定性产生影响。

2.3.5 不同发酵温度对产酶的影响发酵温度不但对菌种的生长有一定的影响，不同的发酵温度对发酵的结果也产生很大的影响。在测定的最佳pH值条件下采用不同的发酵温度(27、32、37、42、47℃)对产酶结果进行优化，结果见图3。由图3可知，最佳发酵温度为37℃，酶活达248.8 U/mL，这一温度也是该菌株生长的最佳温度。当高于37℃后酶活力迅速下降。

2.3.6 不同发酵时间对产酶的影响在上述选定的最佳pH值和温度条件下，对发酵时间(24、36、48、60、72 h)进行试验，结果见图4。由图4可知，随着发酵时间的延长，在24～36 h呈快速增长趋势，48 h酶活达到358.4 U/mL，以后逐渐下降。菌种产酶的高峰时间与菌种的生长期有密切关系，一般在菌体生长的对数期，菌体代谢活动旺盛，分泌胞外酶的活性也最强。

2.3.7 不同转速对产酶的影响分别采用140、160、180、200和220 r/min的转速进行产酶试验，培养24 h后定时取样，镜检观察菌体生长状况，并测定发酵液中的酶活力，结果见图5。在本实验条件下，搅拌速度以180 r/min为宜，产酶高峰期在48 h左右出现，纤维素酶酶活力为216.2 U/ mL。降低搅拌速度，将由于溶氧不足而导致菌体生长变慢，产酶的高峰期延后及酶活力下降。160 r/min时酶活力的峰值拖后至60 h左右出现，且最大酶活力比180 r/min时下降了12.1%。当搅拌速度提高到200 r/min，虽然酶活力的峰值提前至36 h出现，但酶的最大活力却比180 r/min时下降8.9%，这是由于高的转速引起酶蛋白的变性失活;同时在高转速情况下，发酵罐中的泡沫增多，对纤维素酶的合成也不利。

图1 不同接菌量对产酶的影响Fig.1Effect of quantity of inioculation on eniyme formation

图2 不同pH值对产酶的影响Fig.2Effect of finitial pH on eniyme formation

图3 不同发酵温度对产酶的影响Fig.3Effect of temperature on eniyme formation

图4 发酵时间对产酶的影响Fig.4Effect of time on eniyme formation

图5 不同转速在不同时间对产酶的影响Fig.5Effect of shaker’s ratating speed on eniyme formation

2.3.8 正交试验根据液态发酵培养基的组成，设计L9(34)正交试验。试验因素及水平见表4，试验处理及结果见表5。

表4 优化发酵培养基L9(34)正交试验设计Table 4Design of orthogonal text of fermeated calture L9(34)

表5 X-02优化发酵培养基L9(34)正交试验数据分析Table 5Analysis of orthogonal test of X-02 fermeated calture L9(34)

从表5可以得出，接种量2%、pH为8、培养温度为37℃、培养时间为48 h是此芽胞杆菌产酶最佳条件。

2.4 X-02对5种土传病病原菌的抑菌作用

将5种病原菌的菌悬液加入PDA平板上，用无菌刮爬涂匀，在平皿中间放入无菌牛津杯，然后再在牛津杯中加满6株芽胞杆菌发酵液的过滤液，放入28℃恒温箱中培养3～5 d，测量抑菌直径。结果见表6。从表6可以得到X-02对4种土传病害病原菌有防治作用。

表6 X-02对5株病原菌的抑制结果Table 6Inhibition of X-02 to 5 pathogenic

3 讨论

通过对6株芽胞杆菌产纤维素酶的筛选，发现菌株X-02酶活性最高(182.5 U/mL)，并进一步对其发酵条件进行优化，结果显示在碳源2% CMC-Na，氮源2.0%蛋白胨及酵母膏复合，在pH值为8.0、温度37℃、接种量为2%、转速为180 r/min、时间48 h条件下酶活达到391.0 U/mL，比优化前提高了2.1倍，而且该芽胞杆菌对4种土传病害的病原菌具有抑制作用。由于本实验未对发酵培养基组成做精确优化，所以有待进一步研究以提高酶的活性，为产酶芽胞杆菌的筛选提供依据。

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［2］沈雪亮，夏黎明.芽胞杆菌产纤维素酶的研究［J］.林产化学与工业，2002，22(3):54-58.

［3］陈兵，林开江.一株芽胞杆菌产生的碱性纤维素酶的研究［J］.浙江农业学报，1994，6(1):37-40.

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Screening and Enzyme Producing Conditions of Bacillus Strain Inhibited against Soil Borne Pathogen and Produced Cellulase

LIU Xiao-hui，CHEN Shun，CHEN Fei，WANG Hong-qi，HUAN Ming-hui，GAO Xiao-mei，ZHANG Yan，YU Guang-feng，SUN Li-mei，GUO Ling-ling
(Liaoning Acad.of Microbiol.Sci.，Chaoyang 122000)

A Bacillus strain(serial number X-02)was screened among six kinds of Bacillus that excrete extracellular cellulase were screened through DNS spectrophotometer and the Congo red staining，by testing with 5 kinds of pathogen for their inhibition with cup-plate method;and the enzyme activity was as high as 182.5 U/mL and had the inhibition against several soil borne pathogens.Later carbon source，nitrogen source and initial pH of its fermentation medium，temperature，inoculation quantity，rotation of shake flask and time were optimized.The results showed that the best carbon source was 2%CMC-Na，2.0%，the next was glucose，and the difference of the enzyme output was only 21 U/ml，considering the production cost and convenience for large-scale production(slow solubilization of CMC-Na) glucose was chosen as carbon source，and nitrogen source was a compound one of peptone and yeast extract.The enzyme activity was as high as 391.0 U/mL and was 2.1 times as compared with the one before the optimization under the conditions of the pH 8.0，37℃，2%inoculation，180 rpm for 48 h.

cellulase;Bacillus;fermentation;cup-plate method;pathogen

TQ925

A

1005－7021(2011)01－0063－05

国家农业科技成果转化项目(国科发农［2010］297号);辽宁省科技厅攻关计划项目(2009301005)

刘晓辉女，副研究员。现从事微生物研究工作。E-mail:xh194083@sohu.com

2010-08-10;

2010-10-25