波赛链霉菌JMC 06001抑菌活性物质的特性研究

贺建武，刘祝祥，龙华，朱泓溢，肖建青，谭周才，陈义光

(吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南吉首416000)

波赛链霉菌JMC 06001抑菌活性物质的特性研究

贺建武，刘祝祥，龙华，朱泓溢，肖建青，谭周才，陈义光*

(吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南吉首416000)

使用藤黄八叠球菌(Sarcina lutea)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、大肠埃希菌(Escherichia coli)、黑曲霉(Asperillus niger)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、变形杆菌(Proteus vulgaris)、白色念珠菌(Candida albicans)、青霉(Penicillium sp.)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)9种指示菌，采用杯碟法检测抑菌活性。研究了波赛链霉菌JMC 06001菌株(Streptomyces peucetius JMC 06001)发酵液和菌丝体中活性物质的抑菌谱，对由该菌株产生的抑菌物质的温度、pH值、抗紫外线方面的稳定性进行了考察。利用硅胶柱层析和薄层层析对抑菌物质的分离也做了初步的研究。结果表明，该菌株的发酵产物对部分革兰阳性菌、革兰阴性菌和部分真菌有较为明显的抑制作用。稳定性试验结果显示，该菌株产生抑菌活性物质的最适温度为40℃左右，最佳pH值在7.0左右，具有较好的热稳定性和较宽的pH作用范围，抗紫外线辐射能力较强。通过硅胶柱层析分离和薄层色谱检测，显示该菌次生代谢产物中的抑菌活性物质包含了多种成分。

波赛链霉菌;抑菌谱;稳定性

波赛链霉菌(Streptomyces peucetius)能合成多种具有很强抑菌活性的物质［1］，该菌作为生产多种抗肿瘤抗生素的重要菌株而受到研究人员的青睐［2-3］。菌株JMC 06001系由本课题组从高盐泥样中分离到的1株放线菌，根据该菌株的形态学特征、生理生化特征、细胞分化特征和基于16S rRNA基因序列的系统发育分析，被鉴定为波赛链霉菌的1个菌株，并发现其抑菌活性较为突出［4］。用响应面法对该菌株产抑菌物质的发酵条件进行了研究，摸索出JMC 06001较为理想的发酵条件，试验结果另文发表。本文拟对该菌株发酵液的不同溶剂萃取组分以及菌丝体在不同溶剂中的浸出物的抑菌情况进行研究，考察由该菌株产生的抗菌物质在温度、光照、pH值等不同条件下的稳定性，并利用柱层析和薄层指导下进行活性跟踪，对抑菌活性组分的极性大小做了初步的摸索，以期为JMC 06001菌株的开发利用提供一定的理论依据和实践基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株菌株JMC 06001由吉首大学微生物资源与生态实验室从广东省湛江硇洲岛高盐泥样中分离筛选所得。9株抑菌指示菌分别为藤黄八叠球菌(Sarcina lutea CGMCC 1.880)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis ATCC 6051)、大肠埃希菌(Escherichia coli ATCC 128)、黑曲霉(Asperillus niger NCPC 1003)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes ATCC 8724)、变形杆菌(Proteus vulgaris ATCC 8427)、白色念珠菌(Candida albicans NCPC 1027)、青霉(Penicillium sp.ATCC 12556)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa ATCC 27853)。以上菌株均由本实验室提供和保藏。

1.1.2 培养基①菌株JMC 06001斜面培养基采用MA培养基，抑菌指示菌培养基采用NA培养基［5］;②种子培养基:葡萄糖15 g，甘露醇5 g，蛋白胨10 g，酵母膏1 g，牛肉膏2 g，NaCl 60 g，CaCO31 g，复合盐A液20 mL，复合盐B液1 mL，水1000 mL，pH 7.0;③发酵培养基:葡萄糖15 g，蛋白胨10 g，大豆粉14 g，NaCl 30 g，CaCO31 g，复合盐A液20 mL，复合盐B液1 mL，水1000 mL，起始pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 发酵液制备采用复发酵培养法，按

1.1.2 培养基配方配制种子培养基和发酵培养基，种子培养基于28℃，200 r/min振荡培养3 d后得到种子液，转接于发酵培养基，28℃，200 r/min振荡培养5 d，收集发酵液，4000 r/min离心15 min，离心的发酵液和菌丝体分别于4℃下冷藏备用。

1.2.2 不同溶剂萃取物及菌丝体浸出物的制备和抑菌试验①不同溶剂萃取液的制备:取3份发酵液，分别用2倍量体积的乙酸乙酯、氯仿、饱和正丁醇溶液萃取，经减压真空浓缩至干，用甲醇定容于25 mL容量瓶中，4℃下冷藏备用;②不同溶剂菌丝体浸出物的制备:取4份菌丝体，分别用甲醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯各50 mL超声处理15 min，然后在常温下浸出48 h后过滤，滤液经减压真空浓缩至干，用甲醇定容于25 mL容量瓶中，4℃下冷藏备用;③抑菌谱试验(杯碟法［6］):用无菌平皿制备各种含指示菌的混合培养基，迅速放置灭过菌的牛津杯，每个杯中加入100 μL萃取物或菌丝体浸出物样品，将培养皿置于28℃下培养24～48 h后，观察并测量透明圈的直径。

1.2.3 抑菌物质稳定性的测定把1.2.2项剩下的原液和菌丝体浸出物合并，减压真空浓缩至干，取少量用甲醇溶解，即为含抑菌物质的混合液，以藤黄八叠球菌为指示菌。按1.2.2项③的抑菌方法进行下面的试验，每个处理重复3次。①温度对抑菌物质活性的影响:分别取上述混合液1 mL，置于EP管中，在30、40、50、60、70、80、90、100℃条件下保温2 h，检测抑菌活性;②pH值对抑菌物质活性的影响:分别取上述混合液5 mL，用1 mol/L的HCl或1 mol/L NaOH溶液将混合液pH调至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，分别于4℃下保存24 h，检测其抑菌活性;③紫外光对抑菌物质活性的影响:分别取上述混合液1 mL，置于EP管中，用紫外光照射0、5、10、15、20、25、30 min后，进行抑菌试验。

1.2.4 活性物质的初步分离①取1.2.3项下浓缩的浸膏1 g溶于少量氯仿，采用湿法上硅胶柱(100～200目)，柱高约5 cm，以100%、60%、50%、40%、30%、20%、10%和0%的氯仿-甲醇(氯仿∶甲醇，体积比)各20 mL，进行梯度洗脱，流速为6滴/min，用刻度试管收集，每管10 mL;②对每收集的洗脱液以藤黄八叠球菌为指示菌分别进行抑菌实验，找出有抑菌活性的组分;③对活性组分进行薄层色谱分析，选用不同的展开剂考察活性物质的极性情况，在254 nm或365 nm波长下观察并标记。

2 结果

2.1 抑菌谱测定

2.1.1 发酵液萃取物对多种指示菌的抑菌谱

JMC06001菌株发酵液的乙酸乙酯、氯仿、正丁醇萃取物对多种指示菌的抑菌试验结果见表1。

表1 发酵液萃取物对多种指示菌的抑制作用Table 1Inhibition effect of fermentation broth extract using the bacterium indicators

结果显示，该菌株发酵液的乙酸乙酯、氯仿、正丁醇(饱和溶液)萃取物对部分革兰阳性菌、革兰阴性菌和部分真菌有较为明显的抑制作用，这表明该菌株通过发酵培养能产生广谱抗菌的化合物。然而，在各萃取组分中，抑菌效果以乙酸乙酯萃取部分最为显著。除对枯草芽胞杆菌(B.subtilis)外，对变形杆菌(P.vulgaris)、产气荚膜梭菌(C.perfringens)、藤黄八叠球菌(S.lutea)、白色念珠菌(M.albican)的抑制作用都比其他组分要强。在各种抑菌指示菌中，对S.lutea和P.vulgaris的抑制效果最为显著，牛津杯周围均呈现出几乎透明的抑菌圈。

2.1.2 菌丝体浸出物对多种指示菌的抑菌谱该菌株发酵培养后能产生较丰富的菌丝体，利用甲醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯对菌丝体进行浸提，发现其浸出物对多种指示菌也有较强的抑菌作用，见表2。说明该菌株的菌丝体浸出物也能对部分革兰阳性菌、革兰阴性菌和部分真菌有较强的抑制效果，表明JMC 06001菌株的胞内也有广谱抗菌的化合物存在。

表2 菌丝体浸出物对多种指示菌的抑制作用Table 2Inhibition effect of extract from mycelium using the bacterium indicators

2.2 抑菌物质的稳定性考察

2.2.1 温度对抑菌物质活性的影响分别取1.2.3项下的混合液1 mL，分别放置在30、40、50、60、70、80、90、100℃条件下保温2 h，用杯碟法检测抑菌活性，确定温度对抑菌物质活性的影响。由图1可以看出，该菌株产生的抑菌物质活性随着温度的增高而略有升高，在40℃时活性最强，之后稍呈下降的趋势，整个活性增强或减弱的幅度较小，特别是在100℃条件下处理2 h，仍具有90%左右的活性，说明该菌株产生的抑菌物质有较高的热稳定性。

图1 温度对菌株JMC 06001抑菌物质活性的影响Fig.1Effect of temperature on the activity of antibacterial substance of strain JMC 06001

2.2.2pH值对抑菌物质活性的影响将混合液的pH值调节至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，4℃下保存24 h后进行抑菌试验，考察pH值对抑菌物质活性的影响。由图2可以看出，pH值对该菌株产生的抑菌物质活性存在一定的影响，随着pH值的提高，抑菌物质活性相应增强，当pH值为7.0时活性最大;随后抑菌物质的活性随着pH值的上升而逐渐递减。

图2 pH值对菌株JMC 06001抑菌物质活性的影响Fig.2Effect of pH on the activity of antibacterial substance of strain JMC 06001

2.2.3 紫外光对抑菌物质活性的影响用紫外光照射混合液0、5、10、15、20、25、30 min后，进行抑菌实验，确定紫外光对抑菌物质活性影响，见图3。结果显示，紫外光对抑菌物质活性有轻微的抑制作用，在处理30 min后，抑菌活性仍然保持在96%的水平。

图3 紫外光对菌株JMC 06001抑菌物质活性的影响Fig.3Effect of ultraviolet light on the activity of antibacterial substance of strain JMC 06001

2.2.4 抑菌活性成分的初步分离通过对收集的各组分进行抑菌实验，结果显示第2管和第3管溶液对藤黄八叠球菌有抑菌效果，将其合并。取混合溶液进行薄层层析，展开剂按石油醚∶乙酸乙酯为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4(体积比)的展开体系，在饱和碘蒸气下熏蒸1 min后在254 nm或365 nm波长下观察，发现在石油醚∶乙酸乙酯= 1∶3(体积比)时展开效果较好，但存在少量拖尾情况，于是在石油醚∶乙酸乙酯=1∶3(体积比)体系中加入了甲醇，考察石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇为1∶3∶0.1、1∶3∶0.2和1∶3∶0.3(体积比)的新体系，结果发现石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇=1∶3∶0.1(体积比)时，分离效果较好，见图4。

图4 JMC 06001抑菌活性物质薄层色谱图(365 nm)Fig.4Thin layer chromatography(TLC)of antimicrobial substances from strain JMC 06001(365 nm)

通过柱层析和薄层层析的分离和检测，初步确定菌株JMC 06001次生代谢产物中的抑菌活性成分可能为多种物质的混合物，且在石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇=1∶3∶0.1(体积比)的体系中能较好地进行分离。

3 讨论

菌株JMC 06001产生的活性物质抑菌谱广，抑菌效果明显，对部分病原菌如藤黄八叠球菌、产气荚膜梭菌、变形杆菌及真菌中的白色念珠菌均有较强的抑制作用，并且这些抑菌物质具有较好的热稳定性和较宽的pH作用范围，抗紫外线辐射能力较强，通过硅胶柱层析初步分离和薄层色谱检测，显示该菌次生代谢产物中抑菌活性成分包含了多种物质，认为该菌株具有一定的药用开发潜力。

迄今为止，研究者通过分离纯化Streptomyces peucetius的发酵产物得到了一系列的抗肿瘤化合物［7-9］，近几年来国外研究者主要对该菌进行了大量的基因调控方面的研究［10-12］，而本研究分离到的JMC 06001菌株究竟能产生哪些类别的抑菌物质，能否产生广谱高效的抗肿瘤化合物，这些活性物质又该如何进行分离纯化和结构表征，如何从基因工程角度出发揭示某些特殊的基因与化合物之间的调控关系，这些问题都将是接下来工作的重点。

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Characteristics of Antimicrobial Substances by Streptomyces peucetius JMC 06001

HE Jian-wu，LIU Zhu-xiang，LONG Hua，ZHU Hong-yi，XIAO Jian-qing，TAN Zhou-cai，CHEN Yi-guang
(Coll.of Bio-Res.＆Envir.Sci.，Jishou Uni.，Jishou，Hunan 416000)

Antimicrobial spectrum of the fermentation broth and mycelium of Streptomyces peucetius strain JMC06001 were measured with cylinder plate method using nine indicator strains(Sarcina lutea，Bacillus subtilis，E.coli，Aspergillus niger，Enterobacter aerogenes，Proteus vulgaris，Candida albicans，Penicillium sp.，Pseudomonas aeruginosa)，and the stability of antimicrobial substance against temperatures，pH，and UV was observed.Initial research on the isolation of the antimicrobial substance by silica gel column and thin layer chromatography(TLC)was also carried out.The results suggested that the strain JMC 06001 exhibited obvious broad antimicrobial spectrum，including Gramnegative and some Gram-positive bacteria and some fungi.Stability test showed that the most suitable effective temperature and pH of antibacterial substances was 40℃and about 7.0 respectively having fairly broad pH effective range，fairly good thermo stability and fairly strong anti-UV ability.Silica gel column chromatography separation and TLC detection showed that the antimicrobial substances in the secondary metabolites of the strain contained multiple components.

Streptomyces peucetius;antimicrobial spectrum;stability

Q939

A

1005－7021(2011)01－0010－05

国家自然科学基金(30970007);吉首大学研究生科研创新项目(JGY201018)

贺建武男，硕士研究生。研究方向为微生物资源与生态。E-mail:hejwu@163.com

*通讯作者。Tel:0743-8564416，E-mail:mchenjsu@yahoo.com.cn

2010-10-25;

2010-11-21