SVM算法用于黄连解毒汤3种指标性成分配伍浓度与药效作用相关性的研究

朱华旭， 黄 山， 陆文聪， 纽 冰， 郭立玮*

(1．南京中医药大学中药复方分离工程重点实验室，江苏 南京210029;2．青岛科技大学化工学院，山东 青岛266042;3．上海大学理学院，上海210029)

黄连解毒汤为唐·王焘所著《外台秘要》中收藏的一首名方，由四味大苦大寒、泻火解毒药——黄连、黄柏、黄芩和栀子组成，方中以黄连为君，泻心火、兼泻中焦之火;黄芩为臣，泻上焦之火;黄柏为佐，泻下焦之火;栀子为使，通泻三焦之火、导以下行。四药合用，其泻火解毒之效甚著，故适用于表里三焦火热亢盛之证［1］。现代药理研究表明，黄连解毒汤及其有效部位具有明显的抗氧化、改善脑缺血和益智作用［2-3］。

近年来，国内外学者对黄连解毒汤化学成分的配伍变化进行了深入的研究，由于全方酸性与碱性成分共存，汤剂在水煎煮过程中产生大量沉淀，从而造成后续精制分离工艺取舍较难。在前期的研究中，阐明了配伍提取时各指标性成分转移率的变化［4］，并建立了全方水煎煮动态提取过程中，方中指标性成分——总生物碱、总黄酮、小檗碱、药根碱、巴马亭、黄芩苷和栀子苷随时间变化的拟合方程［5］。

为了进一步阐明成分组合的变化可能导致的药效变化［6］，为该药的临床应用与新剂型开发提供实验依据，本实验选用药效学实验结果评价可用于工业化生产的膜分离和大孔吸附树脂技术对黄连解毒汤进行分离精制的有效性，采用数据挖掘技术，研究黄连解毒汤3种指标性成分——小檗碱、黄芩苷、栀子苷的配比浓度与药效作用的相关性，探讨从黄连解毒汤“多元化学组成”与“多靶点作用机理”所表达的极其丰富的生物医学信息中寻找蕴藏其中的药效物质基础的方法［7］。

1 仪器、试剂和试药

Agilent1100高效液相色谱(Agilent 1100四元泵;VWD检测器;Agilent1100 LC色谱工作站);Nuair US Autoflow CO2Water-jacketed incubator;YJ超净工作台(苏州市洁净技术研究所);XSZ-DZ倒置显微镜(重庆光学仪器厂);Spectramax 190酶标仪(美国AD公司);96孔培养板购自COSTA公司;1万分子量PS膜(厦门膜天膜科技有限公司);BT300-1F型蠕动泵(保定兰格恒流泵有限公司);AB-8型大孔吸附树脂(河北沧州宝恩化工有限公司)。对照品(供定量测定用)购自中国药品生物制品检定所，盐酸小檗碱、黄芩苷、栀子苷批号分别为110713-200208、110715-200212、110749-200511。

鼠性肾上腺髓质嗜铬细胞瘤PC-12细胞细胞株由南京中医药大学陆茵教授惠赠。DMSO(34869)、MTT(M2128)购自Sigma公司;培养瓶(CORNING)、滤器(0．22μm)购自 MILLIPORE公司;氯化钾、过氧化氢、连二亚硫酸钠购自国药集团化学试剂有限公司;PBS实验室自制。

2 实验方法

2．1 黄连解毒汤全方水提液的制备 药材黄连(产地四川)、黄柏(产地东北)、黄芩(产地甘肃)、栀子(产地江西)均购自安徽亳州药材公司，批号为090617。称取药材(黄连-黄芩-黄柏-栀子3∶2∶2∶3)0．6 kg，水煎煮2次，第一次10倍量水、第二次8倍量水，每次1．5 h;合并2次煎液，浓缩，得全方水提液(0．2 g 生药/mL 的水提液)［7］。

2．2 黄连解毒汤各分离部位的制备 根据数学组合原理，黄连(君药，A)、黄芩(臣药，B)、黄柏(佐药，C)、栀子(使药，D)4 味药组成 11 个组合［4］，分别为:全方组合(ABCD)、君臣药组合(AB)、君佐药组合(AC)、君使药组合(AD)、君臣佐药组合(ABC)、君臣使药组合(ABD)、君佐使药组合(ACD)、臣佐药组合(BC)、臣使药组合(BD)、臣佐使药组合(BCD)、佐使药组合(CD)，药材按原方比例取样1 000 g，以上述的水煎煮工艺提取，合并2次水提液并调整至0．25 g生药/mL，再采用膜分离技术(1万分子量PS膜超滤液，工艺流程Ⅰ);树脂吸附技术(以70%乙醇等洗脱，工艺流程Ⅱ);每组实验分别标示为组合+工艺流程，共得到22个分离部位。

2．3 药效学实验 取各部位样品，加1%DMSODPBS溶液配制成0．1 g生药/mL，得 a组;依次稀释，得1．0×10－2g生药/mL(b组)，1．0 ×10－3g生药/mL(c组)，1．0 ×10－4g生药/mL(d 组)，1．0 ×10－5g生药/mL(e组)，1．0 ×10－6g生药/mL(f组)。将平均每孔3×104个PC12细胞种于96孔板中，以180μL(高糖 DMEM ∶小牛血清9∶1、双抗100单位/mL)的培养基在37℃、5%CO2培养箱培养24 h，弃去培养液，用DPBS液洗涤2次，再以160 μL(低糖DMEM、双抗100单位/mL)为培养基，对过氧化氢(H2O2)、氯化钾(KCl)、连二亚硫酸钠(Na2S2O4)诱导细胞缺糖缺氧损伤，依次加入各药物浓度各20μL，在37℃、5%CO2培养箱培养24 h后，以570和620 nm为检测波长，测定吸光度，MTT法检测细胞活力［8］。计算出各组吸光度值的平均值(A)、SD值、保护率(B)，计算公式如下:

2．4 全方及各分离部位指标性成分检测 采用HPLC色谱法检测各指标性成分。色谱条件:色谱柱 Lichrospher C18柱(4．6 mm ×250 mm，5 μm)(江苏汉邦公司)，检测波长238 nm(生物碱)、265 nm(栀子苷)、280 nm(黄芩苷);流动相为梯度洗脱，A相为乙腈，B相为0．5%三乙胺(磷酸调pH3．1)，梯度为0～20 min 5%A～15%A，20～40 min 15%A～20%A，40～50min 20%A～30%A，50～55min 30%A ～5%A［4］。样品制备方法为超声提取［4］。

以峰面积为纵坐标(Y)，对照品浓度(mg/mL)为横坐标(X)，绘制标准曲线。盐酸小檗碱标准曲线为 Y=4 ×107X+79 521，R=0．999 9，在0．006 44～0．413 mg/mL之间呈良好的线性关系;黄芩苷标准曲线为 Y=3 ×107X+180 481，R=0．999 8，在0．013 0 ～0．835 mg/mL 之间呈良好的线性关系;栀子苷标准曲线为 Y=1 ×107X+37 266，R=0．999 9，在0．011 4～0．730 mg/mL之间呈良好的线性关系。

3 数据挖掘

3．1 数据挖掘的目标 研究不同分离方法所得黄连解毒汤分离部位中小檗碱量(以盐酸小檗碱计)、黄芩苷量、栀子苷量与细胞保护率之间的相关性，尝试寻找黄连解毒汤中指标性成分的最优浓度配比。

3种指标性成分量与不同细胞模型所得保护率的实验结果，见表1。

表1 黄连解毒汤全方及各分离部位指标性成分量与保护率结果

3．2 实验结果 以小檗碱、黄芩苷、栀子苷的浓度为目标变量，通过数学建模考察3种指标性成分浓度与3种细胞模型保护率之间各自的定性和定量关系。经计算后，初步判断实验数据为非线性，故选用支持向量机(非线性方法)对数据进行分析［9-11］。在WINDOWS环境下，采用MASTER软件计算得到3个非线性方程;方程虽然无法直观地显示各个变量与目标参数之间的关系，但通过对变量和保护率进行敏感性分析，得到指标性成分浓度与保护率之间的对应关系。

3．2．1 3种成分与过氧化氢致损伤保护率相关性考察 相关数据经处理后，其方程如下:

其中y为保护率，X为设定指标性成分的浓度，Xi为在不用分离方法下得到的指标性成分的浓度，βi为函数比例系数(计算参数 c=300，ξ=0．05，δ =1)。

对变量和保护率进行敏感性分析结果如下:当小檗碱-黄芩苷-栀子苷的浓度比为1∶13∶12时，对过氧化氢致致细胞损伤的保护率最高。

3．2．2 3种成分与氯化钾致损伤保护率相关性考察 相关数据经处理后，其方程如下:

其中y为保护率，X为设定指标性成分的浓度，Xi为在不用分离方法下得到的指标性成分的浓度，βi为函数比例系数(计算参数 c=300，ξ=0．05，δ =1)。

对变量和保护率进行敏感性分析未能得出对于氯化钾致细胞损伤的保护率的最优浓度。

3．2．3 3种成分与连二亚硫酸钠致损伤保护率相关性考察 相关数据经处理后，其方程如下:

其中y为保护率，X为设定指标性成分的浓度，Xi为在不用分离方法下得到的指标性成分的浓度，βi为函数比例系数(计算参数 c=300，ξ=0．05，δ =1)。

对变量和保护率进行敏感性分析结果如下:小檗碱-黄芩苷-栀子苷的浓度比为13∶1∶3时，对连二亚硫酸钠造模的保护率最高。

4 讨论

3种损伤细胞模型实验结果表明，AC+Ⅰ、AC+Ⅱ、ABC+Ⅰ、ABC+Ⅱ、ACD+Ⅱ、ABD+Ⅰ、BCD+Ⅰ、ABCD+Ⅰ、ABCD+Ⅱ及全方对3种损伤模型均有保护作用，表明膜分离技术和大孔吸附树脂技术可以有效地精制黄连解毒汤复方［12］。

采用数据挖掘技术对实验数据进行处理，初步得到了3种成分对过氧化氢造模、对连亚硫酸钠造模保护率的最佳浓度分别为小檗碱-黄芩苷-栀子苷为1∶13∶12与13∶1∶3;而对于氯化钾造成的损伤，未能得出最优浓度。对于指标性成分的最优配伍浓度，还需要进行整体动物实验的验证。

支持向量机的数据挖掘方法可以作为黄连解毒汤有效部位物质基础研究的数据处理手段。

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