全蝎匀浆提取工艺研究

侯 林， 田景振， 姬 涛

(山东中医药大学药学院，山东济南250355)

全蝎始载于《开宝本草》，中国药典收载的品种为钳蝎科动物东亚钳蝎Buthusmartensii Karsch的干燥体。辛，平;有毒。归肝经。具有息风镇痉、攻毒散结、通络止痛功能，临床用于小儿惊风、抽搐痉挛、中风口㖞、半身不遂、破伤风、风湿顽痹、偏正头痛、疮疡、瘰疠等症［1］。目前许多抗癌药的成方中，全蝎常为主药，由于有效成分不清楚，多以原粉入药，少数用水、醇提取，全蝎的主要药效成分为蛋白、多肽类，用常规的水醇法不能将其充分的提取而且易使其变性失活［2］。生药粉末直接配药存在制剂量大、水平低，无法制备高效制剂的缺点。本实验采用全蝎匀浆后磷酸缓冲液提取的方法，在单因素考察的基础上以蛋白含有量为指标，利用正交试验设计优选了全蝎蛋白的提取工艺。

1 试验材料与仪器

1．1 试验材料 全蝎药材购自蒙阴县药材公司，经山东中医药大学生药系王厚伟副教授鉴定为钳蝎科动物东亚钳蝎Buthusmartensii Karsch。

1．2 试验仪器 日立UV-3010紫外可见分光光度计(日本日立公司);JJ-2组织捣碎匀浆机(江苏金坛市金伟实验仪器厂);LD4-2A型低速离心机(北京医用离心机厂);BS110分析天平(赛多利斯天平公司);恒温震荡水浴(深圳国华仪器)。

1．3 试剂 甲醇，冰醋酸、磷酸等均为分析纯。

2 试验内容

2．1 提取工艺 将活全蝎洗净晾干后，冰箱冻杀，取10 g冷冻全蝎加入10 mL磷酸盐缓冲液(50 mmol/L，pH 7．2)使用组织捣碎机匀浆后，按不同的条件用恒温振荡器冰水浴震荡提取，提取液3 500 r/min离心15 min，连续提取3次，合并取上清液定容至250 mL。

2．2 样品液的蛋白量测定［3］本部分采用280 nm光吸收测定样品液中的蛋白量，该方法可以快速的对样品液进行测定，该方法不是严格的定量但是对于本部分的蛋白量测定是合适的。

2．2．1 原理［4］蛋白质分子中常含酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等含有苯环的氨基酸，苯环结构在280 nm处有最大吸收，其吸收值与蛋白浓度成正比，故可以采用280 nm波长吸收值的大小来测定蛋白质的量。

2．2．2 样品液中的蛋白量测定方法 用试验用的缓冲液调零，然后分别测定样品在280 nm和260 nm下的吸光度，按以下公式计算蛋白量［5］:

蛋白质质量浓度(mg/mL)=1．55×A280－0．75×A260

2．3 提取次数考察 中药提取过程中，提取次数是影响提取率的关键因素，多次提取可以最大限度的将有效成分提取出来，但多次提取必然加大了提取难度故一般提取2～3次。本部分将全蝎分别提取3次，测定第3次提取蛋白的量来确定是否进行3次提取。

取10 g冷冻全蝎加入10 mL磷酸盐缓冲液(50 mmol/L，pH 7．2)组织捣碎机匀浆，将蝎浆转移至三角瓶中，加入50 mL的缓冲液恒温振荡器冰水浴震荡提取1 h，提取液3 500 r/min离心15 min，取上清液定容至100 mL备用，分别提取3次，重复两遍，样品液测定吸光度并计算质量浓度，结果见表1。

表1 提取次数考察结果

由上述结果可见，第3次提取的蛋白占总量的18．08%，且考虑到全蝎系贵重药材，第3次提取应该保留。

2．4 提取工艺单因素考察 根据经验影响本工艺的因素有加水量、提取时间和NaCl的浓度，由于用本工艺提取全蝎蛋白尚未见报道，需通过单因素试验摸索其提取条件，确定各因素水平。

2．4．1 磷酸盐缓冲液加入量考察 取10 g冷冻全蝎加入10 mL磷酸盐缓冲液(50 mmol/L，pH 7．2)组织捣碎机匀浆，将蝎浆转移至三角瓶中，分别加入 30、40、50、60、70、80 mL的缓冲液，2．1项下的工艺进行提取，每次1 h，提取液合并后测定吸光度并计算浓度，并平行操作3次，结果见图1。

图1 磷酸盐缓冲液加入量考察结果

2．4．2 提取时间考察 取10 g冷冻全蝎加入10mL磷酸盐缓冲液(50 mmol/L，pH7．2)组织捣碎机匀浆，将蝎浆转移至三角瓶中，加入50 mL的缓冲液按2．1项下的工艺进行提取，分别提取 0．5、1、1．5、2、2．5 h，测定吸光度并计算浓度，并平行操作3次，结果见图2。

图2 提取时间考察结果图

2．4．3 NaCl浓度的考察 取10 g冷冻全蝎加入10 mL磷酸盐缓冲液(50mmol/L，pH 7．2)组织捣碎机匀浆，将蝎浆转移至三角瓶中，分别加入50 mL含有1%、2%、3%、4%、5%、6%、8%NaCl的缓冲液按2．1项下的工艺进行提取，每次提取1 h，测定吸光度并计算浓度，并平行操作3次，结果见图3。

图3 NaCl浓度考察结果图

2．5 正交试验 根据单因素试验的结果，确定以280 nm光吸收测定样品液中的蛋白量为指标，考察缓冲液加入量、提取时间、NaCl浓度三个因素对全蝎蛋白提取的影响，以L9(34)正交表进行试验，每次试验称取冷冻全蝎10 g，以正交试验表中各水平，按2．1项下的流程操作，得到提取液若干，按2．2项下的方法测定蛋白，因素水平见表2，正交试验结果及方差分析见表3、表4。

表2 正交因素水平表

以280 nm光吸收测定样品液中的蛋白量指标，由表中的极差的大小显示，各因素作用主次为:C因素(NaCl浓度)﹥B因素(提取时间)﹥A因素(PBS加入量)。表中的方差分析表明:C因素(NaCl浓度)的影响有显著性意义。从直观分析得知最佳提取工艺组合为:A3B3C2。但从生产的实际上考虑，为了节省缓冲液的用量，提高生产效率，采用A2B2C2，即加入5倍量的缓冲液、每次提取1 h，NaCl浓度5%，提取3次。

2．6 验证性试验 取10 g冷冻全蝎加入10mL磷酸盐缓冲液(50 mmol/L，pH7．2)组织捣碎机匀浆，将蝎浆转移至三角瓶中，加入50 mL含有5%NaCl的缓冲液分别恒温振荡器冰水浴震荡提取1h，提取液3 500 r/min离心15 min，取上清液备用，残渣按前法继续提取，共提取3次，定容至250 mL，测定吸光度并计算浓度，结果见表5。

表3 正交试验结果

表4 方差分析

表5 验证性试验结果

3 讨论

本研究根据蛋白质的相关特性，利用稀盐促进蛋白质溶解的原理，使用低浓度的氯化钠缓冲液对全蝎匀浆液进行抽提，通过单因素考察试验和正交试验确定的最佳提取工艺为取冷冻全蝎加入等量的磷酸盐缓冲液(50 mmol/L，pH 7．2)组织捣碎机匀浆，加入5倍量含有5%NaCl的缓冲液冰水浴提取1h，提取液3 500 r/min离心15 min，取上清液备用，残渣按前法继续提取，共提取3次。该工艺操作方便，适用性好，可以直接应用于工业规模生产。

目前许多抗癌药的成方中，全蝎常为主药［6］，由于有效成分不清楚，在中成药生产工艺中全蝎基本是生药粉末直接配料，少数用水、醇回流提取［7～8］，由于全蝎的有效成分主要为蛋白类物质及其水解产物，常规的水、醇提取不能充分的提出这些大分子物质，而且经过加热处理使大量的蛋白类有效成分变性失活，不利于有效物质的保留，采用生药粉末直接配料存在制剂水平低下和微生物超标的问题，孟琳等［9］比较了对全蝎水提取工艺、乙醇提取工艺和匀浆提取工艺的蛋白得率以及抗惊厥药效进行了比较，结果证明匀浆提取工艺的蛋白得率比传统提取工艺高十倍以上，抗惊厥作用也明显强于传统提取工艺。将匀浆提取工艺应用与中药全蝎的提取将解决制约含全蝎中药制剂发展的瓶颈问题，同时也可以应用与其他相关动物类中药的提取过程中。

［1］国家药典委员会．中华人民共和国药典2010版一部［S］．北京:中国医药科技出版社，2010:133．

［2］谭银合，郭建生．全蝎的化学成分及其镇痛作用的研究进展［J］．湖南中医药导报，2001，7(5):210-212．

［3］王家政，范 明主编．蛋白质技术手册［M］．北京:科学出版社，2000:20．

［4］Wetlaufer D B．Ultratiolet spectra of proteins and amino acids［J］．Adv Prot Chem，1962:303-309．

［5］Schleif R F，Wensink P C．Pratical methods in molecularbiology［M］．New York，Springer-Ver．1981:217-219．

［6］郑希林，张洪生．全蝎制剂的临床应用［J］．时珍国医国药，2000，11(9):853．

［7］谭银合，曹道忠，郭建生．全蝎蝎毒蛋白的提取工艺研究［J］．湖南中医药导报，2001，7(6):287-289．

［8］林 超，王玉蓉，吴 清，等．全蝎的酶解工艺研究［J］．北京中医药大学学报，2005，28(6):66-69．

［9］孟 琳，姬 涛，侯 林，等．全蝎匀浆提取工艺的研究［J］．中草药，2010，41(4):577-580．