滋阴经方经TGF-β途径抑制小鼠自发乳腺癌生长的机理

郑里翔， 林栋美， 刘红宁， 余世平

(江西中医学院，江西南昌330004)

乳腺癌是严重危害广大妇女的健康最常见的恶性肿瘤之一。目前国内外对乳腺癌的治疗，仍以手术为主，化疗、放疗、激素和免疫等治疗法，但这些疗法常严重影响患者的生存质量和生存期。而中医药在防治乳腺癌方面的优势日益突显，如可减毒增效、增加患者的生存期和生存质量。中医学认为，乳腺癌发病机制是正虚邪实、虚实夹杂之症，病变与肝肾脾及冲任有密切关系，其中正气不足是乳腺癌发生的主要原因，肝郁脾虚、冲任失调是发生发展的重要因素，而邪气入侵则是重要条件。中医的临床实践已经证明:乳腺癌患者，无论是在发病前、手术后以及放化疗后均会出现阴虚，可见阴虚贯穿于乳腺癌的发生、发展的整个过程，这为中医药防治乳腺癌提供了重要的思路。可见滋阴是防治乳腺癌重要的手段。六味地黄丸是滋阴名方，有大量的有关防治乳腺癌报道［1-5］。前期实验也已证实:该方可抑制自发乳腺癌的生长，但目前该方的作用机理尚不清楚。一系列的实验研究表明:TGF-β信号途径在人类乳腺癌的发展过程中起到关键性的作用，它的表达水平的高低与乳腺癌的轻重有直接的关系［6-7］。故本研究将从TGF-β/ERK信号途径入手，研究六味地黄丸的作用机理。

1 实验材料

1．1 试剂 六味地黄丸购自北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂(批号:北京同仁堂，国药准字Z11021283，每粒0．2 g，每瓶装360粒);Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，PCR引物由上海生工合成，兔抗 TGF-β、p-ERK1/2(ERK1p44，ERk2p42)单克隆抗体购于 SANT CRUZ BIOTECHNOLOGY，INC，辣根过氧化物酶标山羊抗兔IgG单克隆抗体购于北京中杉金桥公司，其他化学试剂都是国产分析纯试剂。

1．2 仪器 ZT-12P生物组织自动脱水机 ，YB-6D生物组织石蜡包埋机，RM2235切片机 LEICA，YT-6C生物组织摊烤片机;OLYMPUS电子显微镜 (日出)，PCR扩增仪(美国)、BIO-RAD垂直电泳仪 (美国)，凝胶成像系统(美国Alpha)，高速冷冻离心机(日本)，PCR仪(美国)，核酸蛋白质分析仪(Eppendorf)。

1．3 实验动物及分组 清洁级昆明小鼠360只，雌性种鼠，已产仔若干代，小鼠鼠龄约为11．5月，平均体质量38～40 g，由江西中医学院动物中心提供(合格证号ZDW-NO．2007-170)。购买后，在封闭环境中、自然光线下进行饲养，保持室内温度18～22℃，相对湿度50% ～60%，小鼠自由进水。每3天触诊乳腺部位一次，发现肿块［8］，随机分成六味地黄丸［分高剂量组4．6g/(kg·d)、低剂量组 2．3g/(kg·d)］和对照组，六味地黄丸水蜜丸，于无菌室内将120粒药丸放入消毒研钵，加100 mL消毒蒸馏水研磨后，装入消毒容器内，配成终质量浓度为0．24 g/mL，置于4℃冰箱备用。按成人剂量12 g/d换算成小鼠给药剂量，患瘤小鼠给药剂量为高剂量4．6 g/(kg·d)，低剂量为2．3 g/(kg·d)。六味地黄丸组灌胃给药，直至患瘤小鼠濒死期(症状:小鼠极度消瘦，精神萎靡，饮食明显减少，表现为反应迟钝，心跳减弱，呼吸微弱，或出现周期性呼吸)，对照组(发瘤未给药)、正常组(未发瘤小鼠)灌胃生理盐水(对照组给生理盐水平均时间为59d;低剂量组给药时间为83d;高剂量给药时间为80．7d)，处死，记录发瘤至濒死期时间，剥离瘤块，称质量。留取部分行病理组织切片确诊(光镜下可见癌细胞排列呈片状、巢状，少部分癌细胞排列呈腺管样，癌细胞核浆比例增大，胞核可见核分裂像)。

2 实验方法

2．1 乳腺癌组织病理分析 取新鲜的癌组织用体积分数为4%的多聚甲醛固定，分别用85% 、95%酒精、无水酒精逐渐脱水，再用二甲苯透明，石蜡包埋，切片与贴片，HE染色，X400观察并拍照。

2．2 半定量的RT-PCR 按照TRIZOL试剂说明书提取总RNA，在20μL反转录反应体积中进行反转录，合成cDNA，取上述逆转录产物PCR扩增。TGF-β、p-ERK上下游引物为:p-ERK1/2:F:5 ＇-TGCACCGTGACCTCAAGCCTT-3 ＇，R:5 ＇-GGCCAGAGCCTGTTCAACTTCAAT-3＇，扩增产物长度491bp;TGF-β1 F:5 ＇-GCAATGGGCTTAGTGTTCTGGGT-3 ＇，R:5 ＇-TGCCTTCCTGTTGGCTGAGTT-3＇，扩增产物长度 295bp;β-actin F:5 ＇-CGTGCGTGACATTAAAGAC-3 ＇，R:5 ＇-CTGGAAGGTGGACAGTGAG-3＇，扩增产物长度 476bp。

25μLPCR反应体系中进行PCR反应(扩增条件为:p-ERK mRNA:95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，57 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，35个循环，72℃终延伸5 min;TGF-β1 mRNA:95℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，35个循环，72 ℃终延伸5 min)。PCR产物用2%琼脂糖凝胶溴化乙锭电泳分离，用凝胶图形分析系统进行拍照，观察结果并测定灰度值，以扩增的目的条带和同时扩增的β-actin的灰度值比对各基因转录水平进行衡量。

2．3 蛋白印迹 用SDS-PAGE电泳，半干转印100 mA 40 min，4℃冰箱封闭过夜，与特异性抗体结合:将一抗用封闭液稀释至适当浓度(兔抗TGF-β1稀释比例为1∶400，小鼠抗p-ERK稀释比例为1∶400);室温下孵育1～2 h后或4℃冰箱孵育过夜，随后用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10 min;再用TBS洗一次，10 min。将二抗用封闭液稀释至适当浓度(辣根过氧化物酶标山羊抗兔IgG稀释比例为1∶25 000，辣根过氧化物酶标山羊抗小鼠IgG稀释比例为1∶25 000)，取3 mL稀释液与膜接触，室温下孵育1～2 h后或4℃冰箱孵育过夜，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10 min;再用TBS洗一次，10 min，进行化学发光反应，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和以β-actin为内参进行上述蛋白的半定量分析。

2．4 统计学处理 应用SPSS15．0统计软件，进行LSD检验，数据采用均数±标准差(± s)表示。

3 结果

3．1 病理分析确诊乳腺癌 经HE染色后，正常小鼠乳腺细胞形态完整，腺管丰富(图1A);对照组细胞数量较多，呈松散、紊乱样排列，以散在和(或)小细胞群为主，腺管消失，细胞核大深染，核多形，层次增多，细胞异型性大，细胞排列杂乱无极性核，大小差异明显(见图1B)，为典型的乳腺癌。

图1 不同组乳腺病理形态(10×40)

3．2 六味地黄丸对肿瘤瘤质量的影响 经六味地黄丸治疗后，瘤质量明显下降(P＜0．01)，说明六味地黄丸能明显抑制肿瘤的生长(见图2)。

3．3 六味地黄丸对瘤体内TGF-β、p-ERK基因表达产物的影响 实验结果表明:六味地黄丸能明显抑制瘤体中的TGF-β、p-ERK 基因的表达(P ＜0．01或 P ＜0．05)。见表2。

图2 六味地黄丸对荷瘤小鼠瘤质量的影响与对照组比较*P＜0．05

表2 六味地黄丸对瘤体内TGF-β、p-ERK基因表达的影响 ( ± s)

表2 六味地黄丸对瘤体内TGF-β、p-ERK基因表达的影响 ( ± s)

注:与对照组比较，*P ＜0．01。

组别 剂量/(g/kg) mRNA 的表达量TGF-βp-ERK蛋白表达量TGF-βp-ERK正常组 0．66 ±0．14(15) 0．50 ±0．13(15) 0．47 ±0．08(14) 1．23 ±0．12(16)对照组 － 1．32 ±0．15(16) 1．14 ±0．14(16) 1．16 ±0．10(16) 3．83 ±0．16(16)六味地黄高剂量组 2．3 0．90 ±0．13*(15) 0．79 ±0．16*(15) 0．74 ±0．06*(15) 2．72 ±0．19*(15)六味地黄低剂量组 4．6 0．77 ±0．09*(16) 0．59 ±0．11*(16) 0．56 ±0．07*(16) 1．37 ±0．11*(16)

4 讨论

目前中医药治疗乳腺癌的方法主要有大补气血、健脾和胃、滋阴补肾、活血养血、清热解毒。黎壮伟等［10］根据晚期乳腺癌的病理特点及疾病发展的不同时期，将乳腺癌分为5型，对于其中肝肾亏虚型者，拟滋补肝肾、调和冲任，方用六味地黄丸加味;周斌等［11］认为乳腺癌骨转移的病因主要是肾虚，加之气血两虚，使其易被癌瘤所侵袭而发病，因此防治乳腺癌常采用以温补肾阳、滋补肾阴、平衡阴阳、调理气血法为主，临床实践已证实:六味地黄丸能改善乳腺癌患者的临床症状，提高患者的生存质量和延长患者的生存期［3-4］。

图2的结果表明:六味地黄丸能明显抑制乳腺癌的生长(P＜0．05)，这是因为方中的熟地黄、山药、山茱萸均能提高机体免疫机能、诱导干扰素产生、抗氧化、抑制肿瘤生长;牡丹皮有调节免疫细胞作用;茯苓具有抗炎的功能［5］，诸药合用达到抑制肿瘤生长目的。

同时六味地黄丸能明显抑制肿瘤组织内的TGF-β/p-ERK的基因表达(P＜0．01或P＜0．05)。研究表明:从果蝇到人类均有TGF-β信号转导途径，TGF-β激活受体，进一步激活ERK。ERK属于酪氨酸蛋白激酶，是MAPK家族主要的和经典的成员，主要传递细胞丝裂原信号，促进细胞增殖。p-ERK是其活化形式。激活的ERK可促进细胞浆靶蛋白磷酸化或调节其它蛋白激酶的活性。更重要的是激活的ERK进入核内，促进多种转录因子磷酸化，增强转录活性，它们所参与的信号传导通路的过度活化与细胞的恶性转化有关［6-7］。故六味地黄丸抑制TGF-β/p-ERK基因的表达，从而抑制了乳腺癌进一步的发展。

由于动物自发性肿瘤从其发生发展来看与人类肿瘤更相似，因而更适用于研究人类肿瘤。该模型最大的特点是实验动物未经任何有意识的人工处理，生存到一定年龄便自然发生乳腺肿瘤，排除了很多人为的干扰因素，使得影响肿瘤发生发展的因素更有可能被发现，因而更具有研究价值和前景［9］。

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