蜂胶抑制白血病K562细胞增殖机制的初步研究*

汪 茗， 章 尧， 戚之琳， 毕富勇

(皖南医学院生化教研室，安徽芜湖241002)

蜂胶(propolis)是蜜蜂从植物幼芽及树木枝条上采集树脂类物质，与其唾液混合加工而成的一种芳香性胶状固体物，含有黄酮、萜烯、肉桂酸衍生物等300多种成分。蜂胶作为民间药物，对于炎症、肿瘤[1]、心脏病[2，3]等均具有治疗或预防作用。核孔复合物贯穿于核膜，是胞核与胞质物质交换的唯一通道，在细胞正常生长、分化过程中发挥着重要作用。其中核孔蛋白98(nucleoporin 98，Nup98)是与白血病发病关系最密切的核孔蛋白。本研究通过观察蜂胶对K562细胞Nup98表达的影响来探讨蜂胶抗白血病作用的分子机制。

材料和方法

1 材料

1.1 细胞株 人慢性粒细胞白血病K562细胞购自中科院上海细胞生物研究所。

1.2 试剂 蜂胶标准品购自Anksteh，用组织培养级的DMSO配成1×105mg/L的贮存液，用时稀释，使DMSO终浓度≤0.1%。PCR引物由上海生工合成。Annexin V－FITC细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物。鼠抗人Nup98单克隆抗体、HRP标记羊抗鼠Ⅱ抗购自Santa Cruz。

2 方法

2.1 分组 分对照组和蜂胶0.2、2、20、200 mg/L组。每组设3个复孔，重复3次，取均值。

2.2 细胞培养 采用含10%胎牛血清的培养液，于37℃、5%CO2、饱和湿度环境下培养。将不同浓度的蜂胶掺入细胞，孵育一定时间后收集细胞进行后续实验。

2.3 MTT检测 取对数生长期细胞，调整浓度为1×108/L，接种于96孔板。蜂胶作用24、48、72 h后取出培养板，每孔加入MTT(5 g/L)20 μL，37℃继续培养4 h后，离心弃上清，加DMSO 150 μL，振荡后酶标仪570 nm下测定各孔的吸光度(absorbance，A)值，按下式计算抑制率。抑制率(%)=(A对照－A实验)/A对照×100%。

2.4 流式细胞术(flow cytometry，FCM)检测 蜂胶作用24 h后收集细胞，Annexin V/PI双染，按说明书处理，1 h内上机检测细胞凋亡率。

2.5 RT－PCR检测 蜂胶作用24 h后，Trizol提取总RNA，紫外分光光度计测RNA纯度(A260/A280＞1.8)。两步法按试剂盒说明进行扩增。Nup98上游引物 5＇－CTAGCAAC AATACTGGAGGC －3＇，下游引物 5＇－ CCTGAATTAGTGGTGGAGGA －3＇，产物612 bp。β－actin 为内参照，上游引物 5＇－TGAGACCTTCAACACCCCAG－ 3＇，下游引物 5＇－ GCCATCTCTTGCTCGAAGTC －3＇，产物 312 bp[4]。扩增条件:95℃预变性 3 min;95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共30个循环;72℃ 10 min，4℃维持。产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，EB染色，捷达801凝胶成像分析系统进行分析。ANup98/Aβ－actin表示Nup98 mRNA表达量的相对水平。

2.6 Western blotting 检测 收集总蛋白，按 100 μg/well上样。10%SDS－PAGE电泳后转膜至NC膜上。5%脱脂牛奶封闭1 h，封Ⅰ抗 Nup98(1∶1 000)4℃过夜。第2 d TBST、TBS洗膜。封HRP标记的羊抗鼠Ⅱ抗(1∶5 000)45 min，同法洗膜。ECL化学发光，将膜置于暗盒中，暗室内胶片曝光，冲洗胶片。Gel－Pro Analyzer定量分析软件分析结果。ANup98/AGAPDH表示Nup98蛋白表达量的相对水平。

3 统计学处理

结 果

1 蜂胶对K562细胞增殖的影响

蜂胶作用 24、48、72 h 后，2 mg/L、20 mg/L 和 200 mg/L蜂胶组K562细胞的增殖抑制率均高于对照组(P＜0.01)，且具有时间和剂量依赖性。其中200 mg/L组72 h的增殖抑制率可达88.76% ±1.42%，见图1。

Figure 1.Effect of propolis on proliferation of K562 cells.±s.n=3.＊＊P ＜0.01 vs A.图1 蜂胶对K562细胞增殖的影响

2 蜂胶对K562细胞凋亡的影响

蜂胶作用24 h后，2 mg/L、20 mg/L和200 mg/L组诱导K562细胞的凋亡率明显高于对照组(P＜0.05)，具有剂量依赖性，见图2。图中右上象限为晚期凋亡细胞或坏死细胞，左下象限为阴性正常细胞，右下象限为早期凋亡细胞，左上象限为机械性损伤细胞。早期凋亡百分数与晚期凋亡百分数总和为总凋亡率。200 mg/L组的细胞总凋亡率可达25.01% ±2.51%。

Figure 2.Effect of propolis on apoptosis of K562 cells.±s.n=3.A:control;B:2 mg/L propolis;C:20 mg/L propolis;D:200 mg/L propolis.＊＊P ＜0.01 vs A.图2 蜂胶对K562细胞凋亡的影响

3 RT－PCR检测nup98mRNA表达

由图3可见，β－actin在各组中的表达水平相似。在612 bp处可见200 mg/L组nup98 mRNA水平明显下调。200 mg/L组nup98 mRNA的相对表达量与对照组相比有显著差异(P＜0.01)，见表1。

4 Western blotting检测Nup98蛋白表达

由图4可见，各组内参照GAPDH的表达量未发生明显变化，而Nup98蛋白表达量却逐渐低于对照组，以200 mg/L组最为明显。200 mg/L组Nup98蛋白的相对表达量与对照组相比有显著差异(P＜0.01)，见表1。

讨 论

Figure 3.Effect of propolis on the expression of nup98 mRNA in K562 cells.Lane 1:marker;Lane 2:control;Lane 3:2 mg/L propolis;Lane 4:20 mg/L propolis;Lane 5:200 mg/L propolis.图3 蜂胶对K562细胞nup98 mRNA表达的影响

表1 蜂胶对K562细胞Nup98 mRNA及蛋白表达的影响Table 1.Effect of propolis on Nup98 mRNA and protein expression in K562 cells(±s.n=3)

表1 蜂胶对K562细胞Nup98 mRNA及蛋白表达的影响Table 1.Effect of propolis on Nup98 mRNA and protein expression in K562 cells(±s.n=3)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.

Group mRNA Protein Control 0.328 ±0.050 1.256 ±0.010 2 mg/L propolis 0.319 ±0.060 1.229 ±0.030 20 mg/L propolis 0.323 ±0.060 1.157 ±0.050*200 mg/L propolis 0.118 ±0.060＊＊ 0.895 ±0.040＊＊

Figure 4.Effect of propolis on the expression of Nup98 protein in K562 cells.Lane 1:control;Lane 2:2 mg/L propolis;Lane 3:20 mg/L propolis;Lane 4:200 mg/L propolis.图4 蜂胶对K562细胞Nup98蛋白表达的影响

已有研究表明，蜂胶可抑制大肠癌[5]、肺癌[6]等多种肿瘤细胞的增殖。本实验结果也证明了在一定的范围内，蜂胶也具有抑制白血病细胞增殖、诱导凋亡的作用，并呈时间、剂量依赖关系，这与之前的报道吻合。

虽然蜂胶的抗肿瘤效应已被证实，但其作用机制却未得到系统阐明。Ishihara等[5]的研究提示，蜂胶的咖啡酸苯乙酯通过降低cyclin D1和c－Myc的表达，导致大肠癌细胞G1期阻滞和凋亡。巴西蜂胶中的阿替比林C通过促进p21CIP1mRNA表达，阻滞细胞在 G0/G1期，抑制其增殖。Cogulu等[7]报道马尼萨蜂胶可通过抑制端粒酶逆转录酶的活性抑制白血病细胞的增殖。也有研究表明蜂胶通过线粒体凋亡途径诱导肿瘤细胞凋亡[8]。

Nup98基因位于11p15.5，编码98 kD的核孔蛋白，位于细胞核的膜内侧及细胞核内。主要参与调节核内外蛋白质和RNA等物质的转运[9]。其N末端FG重复序列的异常与白血病发病关系密切，在许多急性白血病、慢性粒细胞白血病急变期患者可检测到与nup98有关的染色体易位、融合基因及转录产物。目前认为nup98－HOX融合基因的形成是白血病发病的重要原因。Kasper等[10]发现 Nup98 N末端FG重复序列与CBP/P300结合起转录激活作用。也有人推测融合蛋白通过引起核质转运的缺陷而导致白血病的发生。还有研究提示Nup 98协同蛋白RAE－1(retinoic acid early inducible－1，视黄酸可诱导蛋白1)功能紊乱在白血病发生中可能发挥一定作用。

为探讨蜂胶抑制白血病增殖的作用机制，本研究检测了不同浓度蜂胶作用K562细胞后Nup98表达的情况。结果提示，在抑制K562细胞增殖的过程中，Nup98的表达在mRNA和蛋白水平均有下调，提示Nup98表达下调参与了蜂胶抑制K562细胞增殖的过程。但Nup98下调后通过何种信号途径引起增殖抑制，需要我们下一步进行探索。

[1]Mishima S，Narita Y，Chikamatsu S，et al.Effects of propolis on cell growth and gene expression in HL－60 cells[J].J Ethnopharmacol，2005，99(1):5 －11.

[2]张云香，王家富，李 伟，等.蜂胶水提液对体外培养的血管内皮细胞凋亡的影响[J].中国病理生理杂志，2008，24(1):60 －63.

[3]张云香，陈文峰，王家富，等.蜂胶水提物对血管内皮细胞黏附分子表达的影响[J].中国病理生理杂志，2010，26(12):2311 －2315.

[4]吴秋玲，陈 燕，陈卫华，等.鱼藤素对K562细胞nup98表达的影响[J].中国实验血液学杂志，2007，15(1):25 －28.

[5]Ishihara M，Naoi K，Hashita M，et al.Growth inhibitory activity of ethanol extracts of Chinese and Brazilian propolis in four human colon carcinoma cell lines[J].Oncol Rep，2009，22(2):349 －354.

[6]Li F，Awale S，Tezuka Y，et al.Cytotoxicity of constituents from Mexican propolis against a panel of six different cell lines[J].Nat Prod Commun，2010，5(10):1601 －1606.

[7]Cogulu O，Biray C，Gunduz C，et al.Effects of Manisa propolis on telomerase activity in leukemia cells obtained from the bone marrow of leukemia patients[J].Int J Food Sci Nutr，2009，60(7):601 －605.

[8]Eom HS，Lee EJ，Yoon BS，et al.Propolis inhibits the proliferation of human leukaemia HL－60 cells by inducing apoptosis through the mitochondrial pathway[J].Nat Prod Res，2010，24(4):375 －386.

[9]谢志尧，陈 竺.NUP98－HOXA9融合基因与白血病[J].国外医学:输血及血液学分册，2005，28(3):201 －203.

[10]Kasper LH，Brindle PK，Schnabel CA，et al.CREB binding protein interacts with nucleoporin－specific FG repeats that activate transcription and mediate NUP98－HOXA9 oncogenicity[J].Mol Cell Biol，1999，19(1):764 －776.