siRNA干扰BMI－1基因对膀胱癌EJ细胞增殖的调控作用及其机制*

崔学江， 朱定军， 韩金利， 梁 武， 苏嘉锐， 谢文练

(中山大学孙逸仙纪念医院泌尿外科，广东广州510120)

B细胞特异性莫洛尼鼠白血病病毒插入位点1(B-cell-specific Moloney murine leukemia virus insertion site 1，BMI－1)基因过度表达可与多种肿瘤细胞的形成及增殖形成有关[1]。研究表明在膀胱癌细胞中BMI－1亦有较高表达，但其促癌作用机制尚未完全明确。本课题组前期研究表明BMI-1基因在膀胱癌组织中的mRNA及蛋白表达，明显高于癌旁组织，并且其表达量随着肿瘤侵润深度的增加和分化程度的降低而明显升高，且与p16INK4a和p14ARF基因在膀胱癌组织及癌旁组织中的mRNA及蛋白表达量呈负相关[2]。本研究旨在进一步对膀胱癌EJ细胞株及膀胱正常移行上皮细胞中BMI-1、p16INK4a和p14ARFmRNA及蛋白表达水平比较;同时构建siRNA干扰BMI－1基因，检测其mRNA及蛋白表达的影响及对下游p16和p14基因mRNA及蛋白水平的调控作用及对细胞增殖的影响。

材料和方法

1 材料

膀胱癌EJ细胞株及膀胱正常移行上皮细胞株由本实验室惠赠。DMEM培养基、F12K培养基、胎牛血清和无血清培养基Opti-MEM为Gibco产品;RNAiso和real-time RT-PCR试剂盒购于TaKaRa(大连宝生物工程有限公司);siRNA Oligo由上海吉玛公司设计及合成;Lipofectine 2000购自Invitrogen;鼠抗人BMI-1单克隆抗体(05-637)购自Upstate;p16INK4a(sc-468)、p14ARF(sc-8340)购自 Stanta Cruz Biotechnology;β-actin购自Cell Signaling Technology;辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠、羊抗兔IgG购自Multiscience购自联科生物公司;化学发光试剂盒、PVDF膜购自Millipore。

2 细胞培养和siRNA 转染实验分组

BMI－1基因(NM:005180)的siRNA 长度为21 nt，序列见表 1。EJ细胞于含 10%胎牛血清的DMEM培养基，膀胱正常移行上皮细胞用f-12k培养基，37℃、5%CO2条件下培养，0.125%胰酶消化传代。5×108/L细胞种于6孔板，细胞80%融合时进行转染实验。脂质体转染试剂Lipofectamine 2000用于siRNA转染。

使用带绿色荧光的非干扰BMI－1基因的小分子RNA(FAM-nag-siRNA)，6孔板培养细胞，每孔的细胞密度为6.0×105个，培养基2 mL;使用Lipo 5 μL/well，FAM-nag-siRNA共分以下4个浓度:50 nmol/L、75 nmol/L、100 nmol/L 和 150 nmol/L，得出转染率最佳的siRNA浓度进行转染。实验分为5组:A:空白对照组;B:阴性干扰对照组;C:RNA干扰BMI－1基因12 h组;D:RNA干扰BMI－1基因24 h组;E:RNA干扰BMI－1基因48 h组。取转染率最佳的转染浓度转染12 h、24 h、48 h后提取RNA和转染24 h、48 h、72 h后提取蛋白质。

3 实时定量RT－PCR

Trizol两步法提取膀胱正常移行上皮细胞和EJ细胞的总RNA，以mRNA为模板，oligo dT为引物，逆转录成 cDNA，逆转录反应条件为37℃ 15 min，85℃ 5 s。Real-time PCR反应条件为:预变性95℃ 30 s，1个循环;PCR反应95℃ 5 s，60℃ 20 s，40个循环;熔解曲线分析95℃ 1 s，65℃ 15 s，95℃ 0 s。LightCycler(Roche Diagnostics)实时定量PCR检测干扰前后及对照组EJ细胞和膀胱正常移行上皮细胞中BMI-1、p16INK4a和p14ARFmRNA的表达差异。引物序列见表1。

表1 实时定量RT－PCR及RNAi引物序列Table 1.Sequences of primers for real-time RT-PCR and RNAi

4 Western blotting检测

BMI-1、p16INK4a和p14ARF在EJ细胞和膀胱正常移行上皮细胞的表达:按常规方法提取蛋白质并进行定量(Bradford法)。6孔板细胞覆盖80%后以RIPA缓冲液0.8 mL，冰上裂解30 min，12 000×g离心30 min，取上清液并进行蛋白定量。组织及细胞裂解液每道上样量25 μg，10%-15%十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳，低电压转膜过夜。PVDF膜于10%脱脂奶粉封闭4 h，加入抗BMI-1抗体(1∶750)、抗 p16INK4a抗体(1∶250)、抗 p14ARF抗体(1∶250)、抗β-actin抗体(1∶1 000)4℃孵育过夜。TBST漂洗3次，每次10 min，然后加入羊抗鼠及羊抗兔IgG 1∶7 500 1 h，化学发光后X光片曝光。

5 细胞免疫荧光

采用双染法。I抗抗 BMI-1抗体(1∶50)，抗p16INK4a(1∶50)、抗 p14ARF(1∶50);荧光Ⅱ抗，CY3-羊抗小鼠 IgG(1∶75)，FITC-羊抗兔 IgG(1∶50)。核染料采用DAPI染核15 min。

6 生长曲线测定

细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)检测转染后细胞存活情况并绘制生长曲线。

7 统计学处理

结 果

1 细胞免疫荧光结果

BMI-1蛋白在膀胱癌EJ 细胞阳性反应为红色荧光，主要表达于细胞核，部分胞浆亦有荧光染色;p16INK4a和p14ARF蛋白均表达于膀胱癌多种细胞株细胞，阳性呈绿色荧光，两者在细胞核和细胞浆中均可见绿色荧光，细胞核呈蓝光，见图1。

Figure 1.Cellular immunofluorescence of BMI-1，p16INK4aand p14ARFin T24 cells(A)，EJ cells(B)，5637 cells(C)and Tccsup cells(D).BMI-1 displays red.p16INK4a and p14ARFdisplay green(a2 is p16INK4a，b2 is p14ARF).Nuclear displays blue(×400).图1 BMI－1、p16INK4a和p14ARF蛋白在 EJ细胞、T24细胞、5637细胞和Tccsup细胞中的表达

2 BMI－1、p16INK4a和 p14ARF在人膀胱移行上皮细胞及EJ细胞中的mRNA及蛋白表达水平

实时定量RT-PCR检测mRNA水平，BMI-1 mRNA在EJ细胞中表达高于正常膀胱移行上皮细胞，而p16INK4a和p14ARFmRNA在EJ细胞中低表达，P＜0.05，差异显著;Western blotting检测蛋白表达水平，与mRNA表达基本一致，BMI-1蛋白在EJ细胞中表达较正常膀胱移行上皮细胞中高，p16INK4a和p14ARF蛋白表达在EJ细胞中表达低，见图2。

Figure 2.The relative expression levels of BMI-1，p16INK4aand p14ARFin hBTC and EJ cells.±s.n=4.*P＜0.05 vs hBTC.hBTC:human bladder transitional epithelium cells.图2 BMI－1、p16INK4a和p14ARF在EJ细胞及人膀胱移行上皮细胞中mRNA和蛋白的相对表达量

3 不同siRNA浓度的转染率

FAM-nag-siRNA分为以下4个浓度:50 nmol/L、75 nmol/L、100 nmol/L 和 150 nmol/L，测得转染率分别为:(67.25±2.97)%、(81.66±0.64)%、(92.55±0.41)%和(91.56±1.39)%，即siRNA浓度为100 nmol/L时转染效率最高，各组比较差异显著(P＜0.05)，见图3。

Figure 3.Transfection efficiencies of four concentrations of FAM-nag-siRNA(×100).A:50 nmol/L(67.25% ±2.97%);B:75 nmol/L(81.66%±0.64%);C:100 nmol/L(92.55%±0.41%);D:150 nmol/L(91.56%±1.39%);E:transfected EJ cells in white light;F:transfected EJ cells in green light.图3 4种浓度FAM－nag－siRNA的转染率

4 转染后EJ细胞目的基因表达情况

实时定量 RT-PCR检测 BMI-1、p16INK4a和p14ARFmRNA的相对表达量，结果发现，siRNA(100 nmol/L)干扰BMI-1后其mRNA相对表达量在24 h和48 h与空白组相比显著下降(P＜0.05)，而p16INK4a和p14ARFmRNA相对表达量在干扰后12 h、24 h和48 h均比空白组显著上升(P＜0.05)，见图4。

Western blotting检测蛋白相对表达情况发现，siRNA干扰BMI－1后，BMI-1蛋白表达量下降，并且在72 h时下降最明显;p16INK4a和p14ARF蛋白量上升，分别于48 h和72 h上升最明显，见图5。

5 CCK－8分析转染后EJ细胞活力及生长的变化

干扰后的EJ细胞与空白对照组、阴性对照组相比，12 h、24 h EJ细胞存活数无明显变化。48 h开始siRNA干扰组(0.450±0.198)、空白对照组(0.810±0.089)和阴性对照组(0.790±0.099)之间的差异显著(P＜0.05)。干扰BMI－1后EJ细胞在72 h处于生长平台期，生长速度变缓，见图6。

6 EJ细胞的凋亡情况

各组EJ细胞的凋亡率为:空白对照组(5.85±0.31)%，阴性对照组(6.52±0.46)%，干扰48 h后(12.74±0.76)%，干扰72 h后(16.34±0.77)%。空白对照组与阴性对照组比差异不显著(P＞0.05);空白对照组分别与干扰48 h、72 h比，差异均显著(P＜0.01)，干扰48 h与72 h比差异显著(P＜0.01)，见图7。

Figure 4.The mRNA expression of BMI-1，p16INK4aand p14ARF in EJ cells with different treatments.A:BMI-1;B:p16INK4aand p14ARF.NC:normal control;NEG:negative control;12 h:RNAi for 12 h;24 h:RNAi for 24 h;48 h:RNAi for 48 h.±s.n=4.图4 siRNA干扰BMI－1后不同时点 BMI－1、p16INK4a和p14ARFmRNA的表达

Figure 5.The protein levels of BMI-1，p16INK4aand p14ARFin EJ cells with different treatments.±s.n=5.*P＜0.05 vs NC.图5 siRNA干扰BMI－1后不同时点BMI－1、p16INK4a和p14ARF蛋白的表达

Figure 6.Growth curves of EJ cells with different treatments.图6 空白对照组、阴性对照组和RNA干扰BMI－1组的EJ细胞生长曲线

讨 论

BMI－1基因被认为是一种癌基因，其可与cmyc癌基因协同作用引起细胞转化和肿瘤形成。[1，3]。p16INK4a和 p14ARF是重要的抑癌基因，其功能的失活在多种肿瘤的发生中起重要作用[4，5]。但是在肿瘤细胞株及正常的膀胱移行上皮细胞中的比较仍少见报道，并且BMI-1与p16INK4a、p14ARF的调控机制仍未明确。本文通过对其表达及siRNA干扰BMI－1基因后上述基因的表达及蛋白表达的变化进一步明确其调控机制。

Figure 7.The apoptosis of EJ cells detected by flow cytometry.A:normal control(5.85%±0.31%);B:negative control(6.52%±0.46%);C:RNAi for 48 h(12.74%±0.76%);D:RNAi for 72 h(16.34%±0.77%).± s.n=20.*P ＜0.05 vs A.图7 siRNA干扰48 h和72 h后EJ细胞凋亡情况

本研究结果表明:BMI-1 mRNA及蛋白水平在膀胱癌EJ细胞株中的表达比膀胱正常移行上皮细胞的表达水平明显高。对于BMI-1的表达，有研究表明在多种肿瘤细胞中都有高表达，其对造血干细胞、白血病细胞的自我更新起重大作用，在乳腺癌、肝癌、胃癌、大肠癌、肺癌、神经母细胞瘤、黑色素瘤等肿瘤，以及膀胱癌组织、膀胱癌T24细胞株、5637细胞株中均发现较高表达[6-8]。BMI－1基因作为转录抑制因子，对肿瘤细胞的周期调节起抑制作用，影响细胞的增殖及凋亡[8]。膀胱癌EJ细胞株属于恶性度较高的细胞株，目前较少研究BMI-1在其中的表达及调控机制。本研究结果提示在EJ细胞中，BMI-1的高表达，说明膀胱癌EJ细胞中BMI-1为其促癌的一个可能的重要靶点。

对于BMI-1的调控机制，Park等[8]研究表明BMI-1可抑制p16INK4a和p14ARF的表达，导致癌基因过度激活和抑癌基因失活而调节细胞的增殖与凋亡，Liu等[9]研究表明BMI-1与多种蛋白如c-Myc等对cyclin D2进行调节。但亦有研究表明BMI-1调控下游基因存在PI3K/Akt通路[9]及调节端粒酶的活性影响细胞增殖[10]，陈凤花等[11]研究真核表达载体pEGFP-BMI-1转染宫颈癌细胞系HeLa，显著下调 p16INK4a、HOXA9和 HOXC13的表达，而hTERT和HOXB4无明显影响。在膀胱癌EJ细胞中，仍未有明确的研究表明BMI-1的调控机制。

本研究结果显示p16INK4a和p14ARF在EJ细胞中的表达较膀胱正常移行上皮细胞低。以往较多研究使用反义寡核苷酸及shRNA、mircoRNA等抑制BMI－1基因，可以起到抑制作用[12]。本研究使用siRNA干扰BMI－1基因后，BMI-1 mRNA及蛋白水平都有下降，提示使用脂质体转染siRNA可以有效沉默BMI－1基因。沉默后p16INK4a和p14ARF升高，说明两者有相关性，在调节通路上，p16与p14具有某些共同的调节位点。沉默BMI－1后EJ细胞的凋亡增多，提示在EJ细胞中，BMI-1调节细胞增殖的机制主要为调节其下游p16INK4a和p14ARF，并且通过抑制p16INK4a和p14ARF的表达来调节细胞生长。目前研究表明，p16INK4a与调节 cyclin D/CDK4/6有关，而p14ARF与抑制MDM2作用减弱有关，两者都有共同通路就是使E2F转录蛋白增多，细胞增殖增强[13]。

Silva等[14]在乳腺癌中的研究表明 BMI-1对INK4a/ARF的转录抑制是通过其多梳基因家族(PcG)的Mel18和Hpc2蛋白形成多梳组多蛋白抑制复合物1(PRC1)，协同作用抑制。Dhawan等[15]在对胰岛β细胞的研究中表明，BMI-1与PcG家族中的Ezh2蛋白构成PRC1的重要组成部分;Ezh2蛋白导致H3K27三甲基化，增加BMI-1与H2组蛋白、INK4a/ARF位点的结合力，导致H2组蛋白泛素化，抑制INK4a/ARF转录。

综上所述，本研究进一步证实在膀胱癌细胞EJ细胞中，BMI－1是一个重要的癌基因位点，其与cmyc协同作用，调节肿瘤细胞的增殖，可以作为一个检测及治疗的新靶点。同时，使用siRNA干扰技术可以有效沉默BMI－1基因;在膀胱癌EJ细胞中存在p16INK4a/p14ARF调控通路，沉默BMI－1可以通过该通路影响细胞生长周期及凋亡。

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