葡萄籽原花青素通过Nrf2调节糖尿病大鼠肾组织GSTM的表达*

江 蓓， 李保应， 甄军晖， 李宪花， 胡 昭， 高海青△

(山东大学齐鲁医院1泌尿内科，2老年病科，3病理科，山东济南250012)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者最主要的微血管病变，目前已经上升为欧美国家终末期肾脏病(endstage renal disease，ESRD)的首位病因[1]，在我国的发病率也逐年增高。DN治疗费用高、疗效差，严重影响DM患者的生活质量和生存率，故而DN的诊治一直是医学领域研究的热点问题。

DN发病机制十分复杂，包括了众多因素参与。越来越多的研究证实DM患者体内存在明显的氧化应激反应增强，而目前认为氧化应激是DM多种慢性并发症不同发病机制的共同通路，氧化应激在DM肾损害的发生、发展中也起重要作用[2]，可能是DN主要的发病机制之一。由于氧化应激在DM及其慢性并发症发病中的作用越来越明确，有关抗氧化剂替代治疗的研究也进一步引起重视。葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidin，GSP)属天然抗氧化剂，我们以往的研究发现GSP能改善DM大鼠的肾损害，而利用蛋白质组学技术探讨其作用机制，发现了20余个差异表达蛋白可能是GSP的作用靶点[3]。我们对其中的谷胱甘肽S－转移酶μ亚型(glutathione S－transferases mu，GSTM)的作用进行了进一步研究，现报道如下。

材料和方法

1 材料和试剂

1.1 动物 选用健康雄性Wistar大鼠，鼠龄10周，体重200－220 g，购买并饲养于山东大学实验动物中心(合格证号D20021024)。

1.2 抗体和试剂 链脲佐菌素(streptozotocin，STZ，Sigma)、GSTMⅠ抗、核因子E2相关因子2(nuclear factor－erythroid 2－related factor 2，Nrf2)Ⅰ抗(Abcam)、Ⅱ抗(博士德生物工程有限公司)、GSP(天津尖峰天然产物研究开发有限公司生产，批号为G050412。高效液相法分析GSP显示:原花青素含量96.63%)。

2 方法

2.1 糖尿病大鼠模型的建立及分组 健康雄性Wistar大鼠60只，适应性喂养1周后，禁食12h开始实验。随机选取12只作为正常对照组(C组)，其余48只用来建立糖尿病大鼠模型，作为糖尿病组(DM组)。正常对照组一次性尾静脉注射0.1%柠檬酸缓冲液，糖尿病组一次性尾静脉注射0.1%STZ柠檬酸缓冲液55 mg/kg，5 d后取鼠尾血测定血糖，筛选模型成功的大鼠。以STZ注射5 d后，空腹血糖水平≥16.7 mmol/L为糖尿病模型成功的标准。成模后糖尿病大鼠40只，随机分为糖尿病组20只，糖尿病GSP治疗组20只。稳定1周后开始实验。正常对照组(C组)、糖尿病组(DM组)每天给予生理盐水灌胃;GSP治疗组(GSP组)每天GSP 250 mg/kg灌胃。

2.2 标本的收集 所有大鼠标准饲料喂养，自由饮水，持续观察24周，每周用血糖仪(强生公司One－Touch Ultra)鼠尾取血测空腹血糖(fasting blood glucose，FPG)，并测量体重(body weight，BW)，每 6 周检测鼠尾动脉收缩压。于第24周末处死大鼠，取血、留尿、取肾组织。

①尿标本的留取 各组大鼠处死前24 h将其置入代谢笼中，自由进食和饮水，收集24 h尿液，记录尿量后取4 mL，2 000 r/min离心10 min，去除沉淀置于－20℃冰箱保存，待测尿蛋白。

②血标本的留取 处死大鼠后立即穿刺心脏取血4 mL，静置后4 000 r/min离心10 min，收集血清，－20℃冰箱保存待测。

③肾组织的留取 处死大鼠后迅速开腹，分离摘取肾脏，修剪掉纤维结缔组织，0.9%冰生理盐水冲洗，滤纸吸干称重后将其切成2－3mm厚的组织片，置于10%甲醛溶液中固定，用于制作组织切片。

2.3 检测指标及方法

①血压的检测 尾动脉收缩压采用尾套式大鼠心率血压测定仪(中日友好医院生产，RBP－1型)测量大鼠清醒状态下尾动脉收缩压，每6周检测1次，每次测3次，取其平均值。

②24 h尿蛋白测定 采用磺基水杨酸法检测。

③肾功等指标的测定 用Modular D2400全自动生化分析仪(罗氏公司)测定FPG、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(serum creatinine，SCr)、白蛋白、尿酸、总胆固醇、甘油三酯。高压液相法测定糖基化血红蛋白 A1c(glycosylated hemoglobin A1c，HbA1c)。

2.4 肾组织病理学检查 肾组织标本在10%甲醛溶液中固定48 h后，经常规脱水，二甲苯透明40－60 min，浸蜡4 h，包埋成石蜡块。切片机切片，厚约2 μm，将病理切片行PAS染色，光镜下观察病理改变。

2.5 Western blotting检测 称取组织100－200 mg，在研钵中液氮下研磨，加入500－1 000 μL的蛋白提取液，吸入1.5 mL的灭菌离心管中，冰浴20 min，4℃、14 000 r/min离心20 min，吸取上清，分装－80℃保存。BCA法测定样品蛋白浓度。样品加入上样缓冲液12%SDS－PAGE电泳分离蛋白，转膜，5%脱脂奶粉封闭后，依次加入按适当比例稀释的Ⅰ抗(GSTM 1∶1 000，GAPDH 1∶500)，4 ℃孵育过夜，辣根过氧化酶标记的Ⅱ抗(1∶7 500)，室温孵育2 h，DAB显色，应用密度测定法定量分析相应蛋白条带发光度(Digital Protein DNA Imageware)。

2.6 免疫组化检测 标本经10%甲醛固定，石蜡包埋，制成切片后，放于载玻片上置烤箱60℃、60 h使石蜡溶化。切片常规脱蜡至水，经0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)进行热修复，滴加5%BSA封闭液，室温孵育20 min。加适当稀释的Ⅰ抗4℃过夜，漂洗后滴加酶标Ⅱ抗。滴加SABC试剂，37℃孵育20 min。漂洗后DAB显色，苏木素复染。DAB染色呈棕褐色为阳性，每张切片在400倍光镜下随机选取观察10个肾小球不重叠视野，根据染色的范围和强度进行半定量评分。

3 统计学处理

采用SPSS 10.0统计软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。

结 果

1 大鼠一般情况比较

实验结束时，C组、DM组和GSP组大鼠存活分别为10只、9只、13只。DM组大鼠出现多饮、多尿、多食的表现，与C组大鼠比较毛色暗淡无光泽，由于消瘦及多食逐渐呈现大腹小头的形态变化，尾静脉采血后伤口不易愈合。实验开始时3组大鼠体重无显著差异(P＞0.05)，24周时DM组大鼠体重较C组大鼠下降，两者差异显著(P＜0.01)，治疗后GSP组大鼠体重较DM组增加，但2组无显著差异(P＞0.05)，见表 1。

2 GSP对收缩压、FBG和HbA1c的影响

第24周时DM组、GSP组大鼠收缩压、FPG和HbA1c水平与C组相比较均显著升高(P＜0.01)。而GSP组大鼠与DM组相比较FPG和HbA1c水平降低，但两者无显著差异(P＞0.05);收缩压降低，两者差异显著(P＜0.01)，见表1。

表1 GSP对BW、收缩压、FPG和HbA1c的影响Table 1.Effects of GSP on body weight(BW)，systolic pressure，FPG and HbA1c(±s)

表1 GSP对BW、收缩压、FPG和HbA1c的影响Table 1.Effects of GSP on body weight(BW)，systolic pressure，FPG and HbA1c(±s)

＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs DM group.

Group n BW(g) Systolic pressure(mmHg) FPG(mmol/L) HbA1c(%)Control 10 449.10 ±29.97 100.50 ±12.35 6.66 ±0.46 5.61 ±0.73 DM 9 210.13 ±30.05＊＊ 153.50 ±6.26＊＊ 23.03 ±3.38＊＊ 12.40 ±2.35＊＊DM+GSP 13 337.13 ±119.19 130.50 ±5.99＊＊## 21.23 ±3.92＊＊ 11.41 ±2.14＊＊

3 GSP对肾重/体重、尿蛋白和肾功能的影响

第24周时DM组和GSP组大鼠肾重/体重(kidney weight/body weight，KW/BW)、24 h 尿蛋白定量、BUN和SCr水平与C组相比较均显著升高(P＜0.01)。而GSP组大鼠与DM组相比较，24 h尿蛋白定量和肾重/体重降低，两者差异显著(P＜0.01)，BUN和SCr水平降低，两者差异显著(P＜0.05)，见表2。

表2 GSP对大鼠KW/BW、尿蛋白和肾功能的影响Table 2.Effects of GSP on KW/BW，urine protein and renal function(±s)

表2 GSP对大鼠KW/BW、尿蛋白和肾功能的影响Table 2.Effects of GSP on KW/BW，urine protein and renal function(±s)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs DM group.

Group n KW/BW(×10－3) 24 h urine protein(mg) BUN(mmol/L) SCr(μmol/L)Control 10 7.95 ±1.14 14.12 ±2.61 7.59 ±2.98 45.67 ±6.31 DM 9 11.84 ±2.01＊＊ 45.42 ±4.78＊＊ 16.89 ±5.52＊＊ 66.00 ±10.24＊＊DM+GSP 13 9.16 ±1.05*## 17.65 ±2.51*## 11.56 ±3.75*# 56.33 ±7.83＊＊#

4 GSP对肾组织形态学的影响

光镜下PAS染色显示，C组大鼠细胞外基质和系膜细胞均无明显增加，毛细血管管腔开放良好。与C组比较，DM组大鼠肾小球细胞外基质增多，系膜细胞增生，同时毛细血管部分塌陷，肾小囊部分黏连。GSP组治疗后上述改变较DM组减轻，见图1。

5 GSP对肾组织GSTM和Nrf2表达的影响

Western blotting检测和免疫组化结果显示DM组大鼠肾组织GSTM表达较C组增高，两者差异显著(P＜0.01)，而GSP治疗后GSTM表达较DM组减低，两者差异显著(P ＜0.05)，见图2、3。

免疫组化结果显示DM组大鼠肾组织Nrf2表达较C组增高，而GSP组治疗后Nrf2表达较DM组减低(P ＜0.05)，见图4。

Figure 1.The renal pathological changes in the three groups(PAS staining，×400).A:control group;B:DM group;C:GSP treatment group.图1 各组大鼠肾组织病理改变

Figure 2.GSTM protein expression in renal tissues.±s.＊＊P＜0.01 vs control group;#P ＜0.05 vs DM group.图2 肾组织GSTM蛋白表达

讨 论

我们以往的研究发现GSP作为一种天然抗氧化剂，对STZ诱导的DM大鼠模型肾脏损害具有一定的治疗作用[3，4]。本研究结果显示，GSP 治疗组FPG、HbA1c及肾功能均较DM组有改善，24 h尿蛋白较DM组减少;而肾组织病理改变也发现，经GSP治疗后细胞外基质增多、系膜细胞增生情况较DM组减轻。我们利用蛋白质组学技术对GSP的肾保护机制进行了探讨，发现了20余个差异表达蛋白可能是GSP的作用靶点[3]，其中GSTM表达在DM组较C组升高，GSP治疗后GSTM表达下调。在本研究中，我们利用Western blotting和免疫组化方法检测肾组织GSTM的表达，结果与蛋白质组学结果相一致:GSTM表达在DM组较C组升高，GSP治疗后GSTM表达下调。我们同时测定了肾组织Nrf2的表达，结果显示Nrf2表达在DM组较C组升高，GSP治疗后Nrf2表达下调。

以往对GSTM与DM关系的研究较少，主要集中于基因多态性，结果也不完全一致[5－7]。我们研究发现GSTM在DM大鼠肾组织的表达较正常增高，提示这种变化可能在DM肾损害中起一定作用。Fujita等[8]对早期2型DM小鼠模型肾脏588个基因的表达进行了测定，发现GSTs中的α、μ亚型mRNA水平和蛋白质表达均升高，该研究结果与本论文结果有一致性。

DM大鼠肾组织GSTM过表达引起肾损害的机制尚不清楚，可能通过以下途径起作用[9－12]。(1)增强炎症反应:GSTM参与炎性因子白三烯、前列腺素的代谢，GSTM过表达使前列腺素合成增加，从而导致炎症反应的增强。(2)抑制细胞凋亡:丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen－activated protein kinase，MAPK)信号通路是细胞内信号转导的重要方式之一，参与调节细胞凋亡。近年来发现细胞凋亡信号调节激酶 1(apoptosis signal－regulating kinase 1，ASK1)活化可以激活 JNK/SAPK、p38通路级联反应。Cho等[10]研究发现，GSTM在体内外可以直接与ASK1结合并抑制其磷酸化，从而抑制ASK1介导的MAPK通路而影响细胞凋亡。(3)GSTM可作为内源性凋亡影响因子，通过影响淋巴细胞的增殖导致免疫损伤。已经证实，多种应激状态，包括氧化应激，可以诱导 GSTs的表达[13]。本文结果显示，DM大鼠肾组织GSTM表达增高，而GSTM过表达能通过影响肾脏固有细胞的正常凋亡、加重炎症反应等途径加重肾脏损害，从而在DN的发生、发展中起一定作用。GSP治疗可以下调肾组织GSTM的表达，从而发挥其肾保护作用。

Figure 3.GSTM protein expression in renal tissues(immunohistochemical staining，× 400).A:control group;B:DM group;C:GSP treatment group.±s.#P＜0.05 vs control group;*P＜0.05 vs DM group.图3 肾组织GSTM表达

Figure 4.Nrf2 expression in renal tissues(immunohistochemical staining，×400).A:control group;B:DM group;C:GSP treatment group.±s.#P＜0.05 vs control group;*P＜0.05 vs DM group.图4 肾组织Nrf2表达

Nrf2/ARE是近年新发现的机体抗氧化、解毒功能最重要的防御性转导通路。Nrf2是细胞内源性保护系统的关键转录因子，对细胞内氧化还原状态非常敏感。遇自由基或化学物质、氧化应激等刺激时Nrf2活化，活化的Nrf2进入细胞核，与抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)结合，调节ARE下游的Ⅱ相解毒酶、抗氧化蛋白等多种解毒酶的表达[8，14]。本研究结果显示DM大鼠肾组织Nrf2表达较C组增高，GSP治疗后Nrf2表达下调，提示GSP下调DM大鼠肾组织GSTM的表达可能是通过下调上游基因Nrf2的表达实现的。

综上所述，GSP作为一种天然抗氧化剂，对STZ诱导的糖尿病大鼠模型肾脏损害有一定的治疗作用，调节DM大鼠肾组织GSTM的表达可能是GSP发挥肾保护作用的机制之一，而下调GSTM的表达可能是通过下调上游基因Nrf2的表达实现的。

[1]Ziyadeh FN，Sharma K.Overview:combating diabetic nephropathy[J].J Am Soc Nephrol，2003，14(5):1355 －1357.

[2]李晓博，牟忠卿，陈 丽，等.糖尿病大鼠肾脏组织氧化应激及其在糖尿病肾病发病中的意义[J].中国病理生理杂志，2006，22(4):806－809.

[3]Li BY，Cheng M，Gao HQ，et al.Back－regulation of six oxidative stress proteins with grape seed proanthocyanidin extracts in rat diabetic nephropathy[J].J Cell Biochem，2008，104(2):668－679.

[4]Li X，Xu L，Gao H，et al.Effects of grape seed proanthocyanidins extracts on AGEs and expression of bone morphogenetic protein － 7 in diabetic rats[J].J Nephrol，2008，21(5):722－733.

[5]Bekris LM，Shephard C，Peterson M，et al.Glutathione－s－transferase M1 and T1 polymorphisms and associations with type 1 diabetes age － at－ onset[J].Autoimmunity，2005，38(8):567 －575.

[6]Yalin S，Hatungil R，Tamer L，et al.Glutathione S－transferase gene polymorphisms in Turkish patients with diabetes mellitus[J].Cell Biochem Funct，2007，25(5):509－513.

[7]Fujita H，Narita T，Meguro H，et al.No association of glutathione S－transferase M1 gene polymorphism with diabetic nephropathy in Japanese type 2 diabetic patients[J].Ren Fail，2000，22(4):479 －486.

[8]Fujita H，Haseyama T，Kayo T，et al.Increased expression of glutathione S－transferase in renal proximal tubules in the early stages of diabetes:a study of type－2 diabetes in the Akita mouse model[J].Exp Nephrol，2001，9(6):380－386.

[9]Hayes JD，Flanagan JU，Jowsey IR.Glutathione transferases[J].Annu Rev Pharmacol Toxicol，2005，45:51 －88.

[10]Cho SG，Lee YH，Park HS，et al.Glutathione S－transferase mu modulates the stress－activated signals by suppressing apoptosis signal－ regulating kinase 1[J].J Biol Chem，2001，276(16):12749－12755.

[11]Ryoo K，Huh SH，Lee YH，et al.Negative regulation of MEKK1－induced signaling by glutathione S－transferase Mu[J].J Biol Chem，2004，279(42):43589－43594.

[12]Dorion S，Lambert H，Landry J.Activation of the p38 signaling pathway by heat shock involves the dissociation of glutathione S － transferase Mu from Ask1[J].J Biol Chem，2002，277(34):30792－30797.

[13]Hayes JD，Pulford DJ.The glutathione S－transferase supergene family:regulation of GST and the contribution of the isoenzymes to cancer chemoprotection and drug resistance[J].Crit Rev Biochem Mol Biol，1995，30(6):445－600.

[14]甯交琳，莫立稳，王正国，等.不同剂量TNF－α对Nrf2转录调节活性的影响[J].中国病理生理杂志，2010，26(4):791－796.