电针耳甲对癫痫大鼠行为学和脑电图的影响*

何 伟， 赵长龙， 李艳华， 高昕妍， 李 亮， 贲 卉， 荣培晶， 朱 兵

(中国中医科学院针灸研究所，北京100700)

癫痫是脑神经元异常放电反复发作所致的突然短暂中枢神经系统功能失常的一组临床综合征[1]。目前对于癫痫的治疗包括药物治疗、手术治疗、以及非药物替代疗法。非药物替代疗法包括深部脑刺激[2]和迷走神经刺激疗法(vagus nerve stimulation，VNS)[3]等。VNS于1997年被美国 FDA批准用于12岁以上的难治性癫痫病人的辅助治疗，主要通过在颈部放置刺激器，刺激左侧颈部迷走神经干，达到治疗癫痫的效应。迄今为止，全世界有超过70个国家的60 000多名癫痫患者接受了这种治疗。

迷走神经在体表的唯一分支分布于耳甲和外耳道，刺激耳甲是否可以起到治疗癫痫的效应，此种效应与常用治疗癫痫的督脉经穴大椎(Du Meridian 14，DU 14)[4]比较有何差异?本实验拟从行为学、电生理学等方面观察电针耳甲治疗癫痫大鼠的效应，为临床治疗癫痫寻找更简、便、廉、验的方法，同时为进一步探讨耳针的效应机制提供的理论依据。

材料和方法

1 动物

健康成年Sprague-Dawley大鼠48只，雄性，体重(300±29)g，由中国医学科学院实验动物中心提供，清洁级。合格证号为SCXK(京)2009-0008。

2 主要试剂和设备

戊四唑(pentylenetetrazole，PTZ，P6500-25G，Sigma);滂胺天兰 (北京化学试剂公司);计算机恒温控制仪(STARC ST-360);脑立体定位仪;颅骨钻(The Foredom Electric Co.);刺激器(SS-102J，Nikon Kohden);微电极推进器(PF5-1);微电极放大器(Xcell-3 Microelectrode Amplifier，FHC);微电极放大器(World Precision Instruments，WPI);CED1401-plus数据采集系统(Cambridge Electronic Devices);玻璃微电极拉制仪(Model P-97);双芯玻璃毛坯(长度100 mm，外径1.5 mm，内径1.2 mm，南京);双银球电极(自制，球径1 mm);圆形双银片电极(自制，直径1.5 mm);C型双极银质电极(自制，C型凹槽直径3 mm);乌拉坦(ethylurethanm，化学纯，北京化学试剂公司)。

3 主要方法

3.1 动物分组及处理 (1)行为学实验:大鼠24只，随机分为模型组、大椎治疗组(大椎组)和耳甲治疗组(耳甲组)，每组各8只。模型组大鼠造成癫痫模型，观察30 min大鼠行为学的变化;大椎组大鼠电针“大椎”穴30 min后立即造模，观察30 min大鼠行为学的变化;耳甲组大鼠电针耳甲30 min后立即造模，观察30 min大鼠行为学的变化。(2)电生理实验:大鼠24只，随机分为大椎治疗组(大椎组)、耳甲治疗组(耳甲组)和VNS组，每组8只。分别观察造模后电针耳甲、电针“大椎”以及VNS对大鼠脑电图(electroencephalogram，EEG)的影响。

3.2 造模方法 腹腔注射PTZ 60 mg/kg造成急性癫痫模型[5]。

3.3 迷走神经分离术 将大鼠用10%乌拉坦(1.2 g/kg)腹腔注射麻醉。仰卧于手术台，颈部备皮，正中切口长约5 cm，切开皮肤及浅筋膜，沿左侧胸骨舌骨肌及胸骨乳突肌肌间沟进入，显露左侧颈动脉鞘，可见迷走神经位于鞘内，玻璃分针分开颈动脉鞘，游离左侧迷走神经干1 cm备用。将自制C型双极银质电极刺激端无张力地钩于迷走神经干上，两电极相距1-2 mm，将蘸有无菌恒温石蜡油的小棉条轻轻塞于C型电极凹槽内固定迷走神经干(小棉条还可以防止组织干燥和电极短路)，缝合伤口。VNS时C型电极远端与电刺激器相连接。

3.4 硬膜外EEG记录 大鼠10%乌拉坦(1.2 g/kg)麻醉，俯卧，将头部用耳棒固定于脑立体定位仪上。头顶部备皮，沿正中矢状线切开皮肤，分离皮下组织，刮骨刀刮除骨膜，暴露前后囱，将前后囱调至同一水平。根据大鼠脑立体定位图谱(Paxinos＆Watson，1998)，在前囟前(A:1.0 mm，L:1.0 mm)、前囟后(A:-1.0 mm，L:1.0 mm)颅骨表面，用颅骨钻钻孔，暴露硬脑膜。双银球电极置于前囟前、后各一小孔内硬脑膜上，2%琼脂固定。银球电极另一端与微电极放大器相连接。双银球电极另一端接于WPI微电极放大器，放大的电信号经CED 1401计算机数据采集系统采集，数据由Spike 2软件包分析处理。

3.5 刺激方法 选用1.0寸毫针，针刺耳甲或“大椎”穴。“大椎”穴参照实验针灸学定位[6]。VNS或电针时，接于电刺激器。刺激参数根据VNS治疗癫痫的参数[7]为:强度，1 mA;频率，20 Hz;脉宽，500 μs。(1)行为学观察时间:刺激30 s，间隔 5 min，持续30 min。(2)电生理观察时间:刺激30 s。

3.6 检测指标 (1)首次癫痫大发作潜伏期:从腹腔注射PTZ到出现第1次癫痫大发作的时间。(2)首次大发作持续时间:从腹腔注射PTZ到出现第1次癫痫大发作的时间。(3)行为学评分:根据Racine分级标准[8]进行评分。1分:咀嚼，眨眼、立须等面部肌肉抽搐;2分:以点头运动为主的颈部肌肉的抽搐;3分:单侧前肢的阵挛、抽搐;4分:双侧前肢阵挛、抽搐伴身体立起;5分:双侧后肢强直，身体背曲强直，跌倒伴全身阵挛。其中1-3分为小发作，4-5分为大发作。(4)脑电图癫痫波的变化:观察电针刺激抑制癫痫发作的时间，即从刺激后癫痫波被抑制开始到癫痫波恢复到刺激前的时间。

4 统计学处理

数据采用SPSS 13.0统计软件包进行处理和分析。数据以均数±标准误(±sE)表示，多组间比较用单因素方差分析(One-way ANOVA)，组间两两比较采用最小显著性差异法(LSD法)。

结 果

1 电针耳甲对癫痫大鼠行为学的影响

模型组大鼠腹腔注射PTZ 40 s左右开始出现癫痫发作，开始表现为小发作，如凝视、点头运动、双前肢抬起、阵挛等，1-2 min出现大发作，表现为后肢伸直、抽搐、跌倒伴翻滚，PTZ后30 min内大鼠有1-2次大发作，多次小发作。

与模型组比较，耳甲组首次大发作潜伏期延长[(87.13±0.88)s vs(118.88±6.05)s，P ＜0.01];与大椎组比较，耳甲组首次大发作潜伏期延长[(103.50 ±5.63)s vs(118.88 ±6.05)s，P ＜0.05]，见图1。

Figure 1. The latencies of the first grand mal in the three groups.±sE.n=8.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model group;#P＜0.05 vs Dazhui group.AC:auricular concha.图1 3组大鼠首次大发作潜伏期比较

与模型组比较，大椎组和耳甲组首次大发作持续时间缩短[(12.00±0.53)s vs(10.25±0.41)s和(9.00±0.53)s，P＜0.05，P ＜0.01];与大椎组比较，耳甲组首次大发作持续时间变化无显著差异[(10.25±0.41)s vs(9.00±0.53)s，P ＞0.05]，见图2。

与模型组比较，耳甲组大发作行为学评分减少(4.75±0.16)vs(3.63±0.18)，P＜0.01);与大椎组比较，耳甲组大发作行为学评分减少(4.37±0.18 vs 3.63 ±0.18，P ＜0.01)，见图3。

Figure 2.Durations of the first grand mal in the three groups.±sE.n=8.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group.图2 3组大鼠首次大发作持续时间比较

Figure 3.The scores of epileptic behaviors in the three groups.±sE.n=8.＊＊ P ＜0.01 vs model group;##P ＜0.01 vs Dazhui group.图3 3组大鼠行为学积分比较

2 电针耳甲对癫痫大鼠EEG的影响

癫痫波在造模后1-3 min之内开始出现，呈节律性变化，按EEG每出现1次癫痫波记为1次癫痫发作，最初发作3次/min，2 s/次，约7-10 min内持续增多，在约15 min后，呈基本有规律的变化，平均发作约(6.01±0.37)次/min，持续时间(4.28±0.29)s/次，每分钟发作总的持续时间为(24.95±2.87)s。

与电针大椎比较，VNS和电针耳甲抑制癫痫发作的时间增加[(6.01±0.47)min vs(15.96±0.34)min和(16.80± 0.49)min，均 P＜0.01];VNS和电针耳甲比较，差异无显著(P ＞0.05)，见图4、5。

Figure 4.Antiseizure durations in the three groups.±sE.n=8. ＊＊P ＜0.01 vs Dazhui group.图4 3组刺激抑制癫痫发作时间比较

Figure 5.Antiseizure effects induced by different stimulations.A:Electroacupuncture at“DU 14”suppressed epileptic seizures for 5.91 min.B:VNS suppressed epileptic seizures for 15.52 min.C:Electroacupuncture at AC suppressed epileptic seizures for 16.54 min.Stimulations are indicated by horizontal bars.图5 3组刺激抑制癫痫效应比较

讨 论

PTZ致癫痫模型目前被认为是较理想的急性、全身性发作癫痫模型[9]。PTZ是一种γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)依赖的氯离子通道阻滞剂，主要通过影响与GABA相关的氯离子通道的活性，使GABA释放减少，抑制功能减弱，使神经元过度兴奋，引起癫痫发作。腹腔给予PTZ后1-2 min即可引起动物1-5级的癫痫发作，且发作频繁，可持续1 h以上[10]。本实验研究结果与别人报道的结果相吻合，表明此种造模方法成熟可行。

VNS治疗癫痫已经得到了临床验证[11]。有研究提示，VNS可明显延长PTZ致痫大鼠癫痫发作的潜伏期，减轻癫痫发作的严重程度，减少痫波释放的频率[12]。由于VNS是一种有异于生理现象的外界刺激，故亦有一定的不良反应，如声音嘶哑、咽喉疼痛、咳嗽、气喘、感觉异常等[3]。迷走神经耳支是迷走神经在体表的唯一分支，经耳迷走神经刺激可能为治疗癫痫提供一种更简单有效的方法[13]。

以往研究[14]表明，VNS有急性预防性作用，即在VNS后短时间内应用癫痫诱发刺激所诱发的癫痫成功率比没有应用VNS或VNS后很长时间诱发成功率要低很多。本实验研究结果表明，电针耳甲预处理也具有预防癫痫发作的作用。虽然电生理实验表明VNS和电针耳甲抑制癫痫的时间差异无显著，但不能因此断定VNS和电针耳甲抑制癫痫的效应相似。下一步我们将从实验和临床进行此方面的研究。

临床针灸治疗癫痫选穴总的趋势是以任脉、督脉穴位为主，其中“大椎”为常用穴位。本实验发现:电针耳甲、“大椎”穴都能改善癫痫大鼠的行为学表现，且电针耳甲效果优于电针“大椎”的效果。Jia等[15]的实验研究结果表明，电刺激皮质下、神门、枕、脑等耳穴，可以抑制皮层的癫痫皮质脑电图，改善行为学表现，表明耳穴具有抗癫痫的作用;其所选穴位也大多在耳甲区。由此我们推测，耳针抑制癫痫的效应可能与刺激了迷走神经耳支相关。

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