同型半胱氨酸硫内酯损伤血管内皮细胞的机制研究*

刘玉晖， 游 宇

(1江西中医学院药学院药理学教研室，江西南昌330004;2南昌大学附属第一医院消化内科，江西南昌330006)

流行病学研究证明，高同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)血症是人类许多疾病的独立危险因素，如冠状动脉粥样硬化性心脏病、脑中风、外周血管栓塞性疾病等[1，2]。正常情况下，Hcy在甲硫氨酸合酶或甜菜碱－Hcy甲基转移酶作用下，转变为甲硫氨酸，或在胱硫醚 β－合成酶(cystathionine β－synthetase)和维生素B6作用下，通过转硫过程分解为胱硫醚，继而转变为半胱氨酸。如果遗传性地缺少关键酶以及维生素B12等维生素时，Hcy不能进行正常的转化与代谢，而是在氨酰基tRNA合成酶(aminoacyl－tRNA synthetases，AARSs)作用下，进行分子内的反应，Hcy侧链的巯基与羧基反应，形成Hcy硫内酯 (homocysteine thiolactone，HTL)[3]。 目 前 对 于HTL引起细胞损伤的机制尚不清楚，推测可能与诱导活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的形成有关。血管内皮细胞(endothelial cells，ECs)不仅是血液与血管平滑肌之间的生理屏障，也是一个高度活跃的代谢库，它可以合成多种活性物质，如一氧化氮(nitro oxide，NO)、内皮素、缓激肽等，在调节血管的舒缩活动与血液的流动性方面起着十分重要的作用[4]。高Hcy血症可引起血管功能损伤和动脉粥样硬化的发生，Hcy的致病作用主要与Hcy在体内生成了HTL有关。本实验利用培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)模型，观察HTL对内皮细胞的直接损伤作用，旨在从细胞和分子水平探讨HTL损伤内皮细胞的机制，寻找其干预靶点，探索治疗途径。

材料和方法

1 试剂与仪器

HTL、NADPH氧化酶抑制剂夹竹桃麻素(apocynin，Apo)、NF－κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)、胰蛋白酶和 DMSO(Sigma)。DMEM培养基(Gibco)。小牛血清(杭州四季青公司)。HUVECs细胞株从北京协和医科大学肿瘤研究所购买(来源于美国ATCC细胞库，属于正常的 HUVECs，vWF抗原阳性，编号 CRL－2480，具有贴壁生长、接触抑制、密度依赖性等生物学特征)。NO试剂盒、NF－κB活性试剂盒、ROS检测试剂盒和MTT细胞增殖检测试剂盒和BCA蛋白浓度试剂盒(碧云天生物技术研究所)。Anti－IκBα(BioLegend)。TNF－α和sICAM－1的ELISA试剂盒(ADL)。抗氧化剂N－乙酰半胱氨酸(N－acetyl cysteine，NAC，碧云天生物技术研究所)。其余试剂为国产分析纯。

DMEM用纯化水溶解，NaHCO3调pH值至7.2－7.4，滤过除菌后4℃保存。小牛血清56℃，30 min灭活补体后分装，－20℃冻存。临用时培养基加入相应量的小牛血清与青霉素(1×105U/L)和链霉素(100 mg/L)。

UV755B型紫外分光光度计(上海仪器厂)、CO2培养箱(FORMA311，上海瑞仰净化装备有限公司)、IX70型倒置相差显微镜(Olympus)、IJ－6A低温离心机(Beckman)、Eppendorf离心机(Eppendorf)、Model 3.9 EL酶标仪(Bio－Rad)、PE2400PCR仪(Perkin－Elmer)、Gel Doc 2000分子成像仪(Bio－Rad)和荧光显微镜(Olympus)。

2 方法

2.1 实验设计与分组 实验分组如下:(1)正常对照组:用DMEM培养液孵育细胞;(2)HTL处理组:分别用含有0.1、0.3、1 mmol/L HTL的培养液孵育内皮细胞;(3)NAC+HTL组:在加入5 mmol/L NAC培养液孵育1 h后，再与HTL共同孵育内皮细胞;(4)PDTC+HTL组:加入0.1 mmol/L PDTC培养液孵育1 h后，再与HTL共同孵育内皮细胞;(5)Apocynin+HTL组:加入0.1 mmol/L Apo培养液孵育1 h后，再与HTL共同孵育内皮细胞。

2.2 人脐静脉内皮细胞的培养 取HUVECs解冻复苏后加入含10%小牛血清DMEM培养液制成细胞悬液，分别接种于100 mL细胞培养瓶，置37℃、5%CO2培养箱中贴壁培养，每隔2－3 d换液1次，待细胞80%融合时用0.25%胰蛋白酶消化传代。用含10%小牛血清的DMEM培养液稀释细胞至1×107/L、3×107/L、1 ×108/L，然后分别将细胞接种于96、24、6孔培养板中，待细胞80%融合时换成含1%小牛血清DMEM培养液继续培养24 h，使细胞达到同步化，然后分别加入不同的处理因素。

2.3 MTT比色法检测细胞活力 将培养至第4代的单层内皮细胞按常规消化后制成细胞悬液，以每孔103－104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积为150 μL。培养结束后，每孔加入MTT溶液(5 g/L)15 μL 37℃继续孵育4 h，终止培养，弃除孔内的培养上清液。每孔中再加入150 μL DMSO，振荡10 min，使得结晶物充分溶解。用酶联免疫检测仪在490 nm波长处测定各孔的吸光度值。

2.4 细胞培养液中LDH活性测定 LDH能够催化乳酸生成丙酮酸，后者与2，4－二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中呈现棕红色，颜色深浅可间接反映LDH的活性，通过比色法测定其吸光度，计算酶的活力。具体严格操作按照试剂盒说明书进行，按下列公式计算:

LDH(U/L)=(测定管A值－测定空白管A值)÷(标准管A值－标准空白管A值)×标准管浓度(2 μmol/L)×1 000 mL×测试前样品稀释倍数。

2.5 NO的检测 此法按试剂盒介绍操作，标准溶液用DMEM(+10%FBS)溶液进行稀释和配制，浓度为(μmol/L):0、1、2、10、20、40、60 和 100，样品为细胞培养液上清。每孔分别加上述溶液50 μL、Griess reagent I、Griess Reagent II溶液。即刻用酶标仪在540 nm波长处测定吸光度值。绘制标准曲线，然后根据标准曲线得出相应的数值。

2.6 ROS的检测[5]利用荧光探针 DCFH－DA进行ROS的检测。DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。DCF的荧光可反映细胞内活性氧的水平。

用无血清培养液按照1∶1 000比率稀释DCFH－DA，使终浓度为10 μmol/L。去除细胞培养液，加入1 mL稀释好的DCFH－DA。37℃细胞培养箱内孵育20 min。用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH－DA。盖玻片封片后荧光显微镜下观察。使用488 nm激发波长，525 nm发射波长，用荧光分光光度计检测刺激前后荧光的强弱。

2.7 NF－κB活性的检测[6]弃除培养液并用PBS液洗涤细胞1次。加固定液固定细胞15 min。弃除固定液，用PBS洗涤3次，每次3 min。用免疫染色封闭液室温下封闭1 h，弃除免疫染色封闭液，加入NF－κB p65抗体，室温下孵育1h并用PBS液洗涤3次，每次8 min。加入1 mL抗兔Cy3，室温孵育1 h。洗涤液洗涤2次，每次5－10 min。加入1 mL细胞核染色液(DAPI)，吸除细胞核染色液，再用PBS液洗涤3次，每次5 min。滴加适量的抗荧光淬灭封片液，盖玻片封片后荧光显微镜下观察。NF－κB的染色为红色荧光，细胞核的DAPI染色为蓝色荧光。

2.8 免疫印迹法检测IκBα 蛋白表达[7]细胞总蛋白提取:将1×108/L的细胞悬液接种于6孔培养板中，置5%CO2培养箱，37℃培养，待细胞生长至80%，换含1%小牛血清的DMEM培养液继续培养24 h使细胞处于静止期。药物处理后加入PBS冲洗3 次，加入 100 μL 细胞裂解液(20 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，1%Triton X － 100，1%sodium pyrophosphate，25 mmol/L β － glycerophosphate，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L Na3VO4，0.5 mg/L leupeptin，临用时加入PMSF)置冰上裂解30 min，收集细胞。12 000 r/min、4℃离心30 min取上清液，按照BCA试剂盒说明书进行测定蛋白浓度。蛋白质SDS聚丙烯酞胺凝胶电泳:装备胶槽，制备分离胶加入胶槽，上层加入少量水。待分离胶聚合完全后，用去离子水洗涤。随后灌注积层胶，插入梳子，待堆积胶聚合后，拔去梳子，用去离子水冲洗加样孔去除残留的未聚合的胶。将玻板装入电泳槽中，加入电泳缓冲液。将样品加入上样孔，其中一孔加入5－10 μL预染的蛋白质分子量marker。常规垂直电泳，待电泳结束后，卸下玻璃板取下凝胶，对凝胶进行 Western blotting检测。

Western blotting检测:使用电转移系统将蛋白质从聚丙烯酞胺凝胶转移至硝酸纤维素滤膜，转膜完毕，将膜放入封闭液中，室温下封闭1 h。将IκBαⅠ抗按1∶500稀释加入封闭液中，50 r/min离心，4℃过夜。洗涤Ⅰ抗，用兔IgGⅡ抗1∶10 000稀释后加入，室温下1 h，洗涤Ⅱ抗。避光加入ECL溶液，反应5 min，滤除多余的ECL液，在将膜放入显影夹于暗室中显影，曝光3 min，将膜显影、定影。根据显色条带适当调整曝光时间和显影时间使条带更清晰。

2.9 TNF－α和sICAM－1浓度测定 采用双抗体夹心ELISA法，检测TNF－α和sICAM－1水平。

3 统计学处理

结 果

1 HTL对内皮细胞活力的影响

细胞与 HTL(1 mmol/L)孵育6 h、12 h和24 h后均能时间依赖性地降低内皮细胞的活力，以24 h最明显;HTL(0.1、0.3、1 mmol/L)孵育24 h后可以浓度依赖性地降低内皮细胞活力，以1 mmol/L最明显。因此用HTL 1 mmol/L孵育24 h作为实验浓度与时间。如表1所示，1 mmol/L HTL与内皮细胞共同孵育24 h可以显著降低内皮细胞活力(P＜0.01)，而PDTC、Apo与NAC均能够不同程度地抑制HTL诱导的内皮细胞活力的下降(P＜0.01)。

表1 各组处理因素对HTL诱导内皮细胞活性、LDH、NO和ROS的影响Table 1.Influence of different group on cell viability，LDH，NO and ROS in ECs induced by HTL(±s.n=3)

表1 各组处理因素对HTL诱导内皮细胞活性、LDH、NO和ROS的影响Table 1.Influence of different group on cell viability，LDH，NO and ROS in ECs induced by HTL(±s.n=3)

＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs HTL.

Group Cell viability LDH(U/L) NO(10－6mmol/L)ROS Control 0.89 ±0.09 84.3 ±7.2 24.7 ±3.1 0.11 ±0.01 HTL(1 mmol/L) 0.39 ±0.07＊＊ 172.7 ±12.4＊＊ 7.6 ±1.6＊＊ 0.37 ±0.02＊＊NAC(5 mmol/L)+HTL 0.80 ±0.10## 110.5 ±10.8## 18.5 ±2.1## 0.16 ±0.01##Apo(0.1 mmol/L)+HTL 0.75 ±0.08## 131.6 ±11.2## 16.1 ±2.0## 0.13 ±0.01##PDTC(0.1 mmol/L)+HTL 0.71 ±0.08## 125.3 ±13.1## 13.5 ±1.9## 0.23 ±0.02##

2 HTL对内皮细胞培养液中LDH活性的影响

如表1所示，HTL(1 mmol/L)与内皮细胞孵育24 h显著增加培养液LDH活性，PDTC、Apo与NAC均能够不同程度地抑制HTL诱导的LDH活性的增加(P＜0.01)。

3 HTL对内皮细胞NO水平的影响

HTL(1 mmol/L)孵育6 h、12 h或24 h后均能显著降低内皮细胞中NO含量，以24 h最明显;HTL(0.1、0.3、1 mmol/L)作用24 h后可以剂量依赖性地降低内皮细胞中NO的含量，以1 mmol/L最为明显。因此用HTL 1 mmol/L孵育24 h作为实验的浓度与时间。如表1所示，1 mmol/L HTL与内皮细胞共同孵育24 h可以降低内皮细胞中NO的含量，PDTC、Apo与NAC能够不同程度地升高内皮细胞中的NO含量(P＜0.01)。

4 HTL对内皮细胞中ROS水平的影响

HTL(1 mmol/L)作用1 h、3 h或6 h后均能显著增加内皮细胞中ROS含量(P＜0.01)，以3 h最明显;HTL(0.1、0.3、1 mmol/L)作用3 h后可以剂量依赖性地增加内皮细胞中ROS的含量，以1 mmol/L最为明显。因此用HTL 1 mmol/L孵育3 h作为实验浓度与时间。如表1及图1所示，预先使用0.1 mmol/L Apo、5 mmol/L NAC和0.1 mmol/L PDTC均能够显著减少内皮细胞中ROS的产生(P＜0.01)。

Figure 1.Influence of different treatments on ROS production in ECs(fluorescence microscope， × 200)A:positive control group;B:negative control group;C:HTL(1 mmol/L)group;D:PDTC(0.1 mmol/L)+HTL group;E:NAC(5 mmol/L)+HTL group;F:Apo(0.1 mmol/L)+HTL group.图1 各组处理因素对内皮细胞ROS水平的影响

5 HTL对内皮细胞中NF－κB活性的影响

HTL(1 mmol/L)作用1 h、3 h或6 h后均能显著增加内皮细胞中NF－κB的激活，其中以3 h最明显;HTL(0.1、0.3、1 mmol/L)作用3 h后可以剂量依赖性地增加内皮细胞中NF－κB的活性。因此用HTL 1 mmol/L孵育3 h作为实验浓度与时间。如图2所示，预先使用0.1 mmol/L PDTC、0.1 mmol/L Apo和5 mmol/L NAC均可以显著抑制内皮细胞中NF－κB的激活。

Figure 2.Influence of different treatments on NF － κB in ECs(fluorescence microscope，×400).A:merged;B:DAPI staining for nuclei(blue);C:NF － κB p65(red).图2 各组处理因素对内皮细胞NF－κB活性的影响

6 HTL对内皮细胞中IκBα蛋白表达的影响

图3显示的是HTL(1 mmol/L)作用0 h、0.5 h、1 h、3 h和6 h对IκBα蛋白表达的时效关系，从1 h以后HTL均能显著降低内皮细胞中IκBα蛋白的水平，其中以3 h最明显。因此用HTL 1 mmol/L孵育3 h作为实验浓度与时间。如图4所示，与正常组相比，1 mmol/L HTL与内皮细胞共同孵育3 h后，可以显著降低内皮细胞中IκBα蛋白的表达，预先使用0.1 mmol/L PDTC、0.1 mmol/L Apo和 5 mmol/L NAC均可以显著增高内皮细胞中IκBα蛋白的水平。

Figure 3.Effect of HTL(1 mmol/L)on IκBα protein expression in ECs at different time points.±s.n=3.＊＊P＜0.01 vs 0 h.图3 HTL对内皮细胞IκBα蛋白表达的时效关系

7 HTL对内皮细胞中sICAM－1和TNF－α浓度的影响

HTL(1 mmol/L)作用6 h、12 h和24 h均能显著升高内皮细胞上清液sICAM－1和TNF－α浓度，以24 h最明显;HTL(0.1、0.3、1 mmol/L)作用 24 h 后可以剂量依赖性地升高内皮细胞上清液中的sICAM－1、TNF－α浓度，以1 mmol/L最为明显。因此用HTL 1 mmol/L孵育24 h作为实验浓度与时间。如表2所示，预先使用 PDTC 0.1 mmol/L、Apo 0.1 mmol/L、5 mmol/L NAC可以显著降低内皮细胞中sICAM－1、TNF－α浓度(P＜0.01)。

讨 论

本研究发现，HTL显著诱导了内皮细胞功能受损，表现为内皮细胞活力下降，LDH漏出增加，抗氧化剂NAC、Apo以及NF－κB抑制剂PDTC与血管内皮细胞预孵，显著减轻了HTL诱导的内皮细胞活力降低、LDH漏出。

Figure 4.Influence of different treatments on IκBα protein expression in ECs.1:control group(3 h);2:HTL(1 mmol/L，3 h)group;3:PDTC(0.1 mmol/L)+HTL(1 mmol/L，3 h)group;4:NAC(5 mmol/L)+HTL(1 mmol/L，3 h)group;5:Apo(0.1 mmol/L)+HTL(1 mmol/L，3 h)group.±s.n=3.*P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs HTL.图4 不同时候HTL对IκB－α蛋白表达的影响

表2 内皮细胞培养上清液中sICAM－1和TNF－α水平Table 2.Influence of different treatments on sICAM －1 and TNF－α content in culture supernatants of ECs(ng/L.±s.n=3)

表2 内皮细胞培养上清液中sICAM－1和TNF－α水平Table 2.Influence of different treatments on sICAM －1 and TNF－α content in culture supernatants of ECs(ng/L.±s.n=3)

＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs HTL.

Group sICAM－1(ng/L) TNF－α(ng/L)Control 338.6 ±22.3 82.1 ±9.0 HTL(1 mmol/L) 1 025.8 ±33.7＊＊ 321.5 ±16.4＊＊NAC(5 mmol/L)+HTL 565.2 ±29.5## 180.2 ±15.1##Apo(0.1 mmol/L)+HTL 608.1 ±30.1## 168.3 ±12.3##PDTC(0.1 mmol/L)+HTL 532.2 ±25.2## 192.6 ±14.6##

氧化应激即体内ROS的蓄积。细胞内活性氧的来源多种多样，除线粒体呼吸链代谢产生以外，现有研究证实，内皮细胞中的ROS主要来源于NADPH氧化酶途径。NADPH氧化酶是细胞内一种可诱导性电子转运系统，利用NAD(P)H作为电子供体被单电子还原而催化氧分子生成超氧阴离子[6，7]。本实验证实，HTL可以显著增加ROS的产生，给予NADPH氧化酶抑制剂Apo以及NAC可以明显降低细胞中ROS含量。

NF－κB是一种由p50以及p65两种亚基组成的异源二聚体，未被激活时和IκBα形成一个复合物，分布在细胞浆中。在炎症因子、生长因子或趋化因子等可以激活NF－κB的刺激存在的情况下，IκBα会在Ser32和Ser36被磷酸化，随后被泛素－蛋白酶体途径降解。NF－κB和IκBα解聚后，其核定位序列被暴露，从而被转运到细胞核内促进NF－κB依赖的基因转录。NF－κB转录因子家族成员调控许多与炎症相关的基因表达，如 TNF－α、IL－1、ICAM－1、VCAM－1等，而这些因子在动脉硬化发生发展过程中的各个环节均起重要作用[8，9]。大量实验证据证明，氧化应激诱导NF－κB的胞质－核转位，而抗氧化剂如NAC、PDTC能抑制IκB激酶的活性，阻止其被磷酸化和最终被降解，抑制NF－κB的转位[10－11]。因此，氧化应激激活 NF － κB 的关键环节可能是通过信号转导的级联反应而引起IκB磷酸化和最终被降解。本实验所用NF－κB激活－核转运检测试剂盒仅染色p65，不染色RelB、C－Rel、p50和p52，使用后NF－κB呈红色荧光，细胞核呈蓝色荧光。通过免疫染色检测NF－κB的主要亚基p65是否被转移到细胞核内，就可以判断NF－κB是否被激活。实验发现，HTL增加了细胞中ROS的生成，降低了IκB的蛋白表达水平，1 mmol/L HTL可以明显激活NF－κB;而预先给予Apo、NF－κB抑制剂PDTC和抗氧化剂NAC均可显著提高IκBα的蛋白表达水平，从而抑制NF－κB的激活。

血管内皮功能紊乱是动脉粥样硬化最早的特征之一，而这种内皮功能紊乱的一个重要原因是血管壁的慢性炎症刺激。正常血管内膜通常不发生白细胞黏附，但是在动脉硬化的早期阶段，随着内皮细胞的损伤，在刺激因子的介导下，内皮细胞开始表达包括TNF－α、ICAM－1等炎症因子。研究发现，ICAM－1是介导细胞间或细胞与基质间相互结合、相互作用的一类位于细胞膜表面的糖蛋白，主要参与炎症细胞的黏附与聚集[12];TNF－α是触发血管内皮炎症反应的启动子，可以诱导内皮细胞、单核细胞产生IL－6、上调ICAM－1的表达，促进中性粒细胞与内皮细胞的黏附[13]。本研究发现，HTL可以刺激内皮细胞产生大量的TNF－α、sICAM－1，而预先给予Apo以及PDTC、NAC可以显著地降低内皮细胞中TNF－α、sICAM－1的浓度。

综上所述，本研究证实同型半胱氨酸硫内酯引起血管内皮细胞的损伤可以通过激活NADPH氧化酶导致氧化应激，活化NF－κB并且使其进入细胞核内造成炎症因子sICAM－1、TNF－α的增多有关。

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