人类纤维化心脏瓣膜噬菌体表达文库的构建及质量分析*

孟锦绣， 李运雄， 朱 平， 卢 聪， 郑少忆， 余细勇△

(1广东省人民医院/广东省医学科学院医学研究中心，2广东省心血管病研究所，广东广州510080)

瓣膜病(valvular heart disease，VHD)是我国最常见的一种多发性心脏病，可由风湿性、退行性和缺血性等多种病因引起，每年需要进行瓣膜手术的患者达20多万例，占成人心脏手术第1位[1]。各种病因所导致的瓣膜纤维化在各种年龄段上都有发生，危害最为严重。但是至今人们对导致瓣膜纤维化的分子机制还知之甚少，了解心脏瓣膜纤维化状态下哪些分子参与了纤维化的形成是至关重要的工作。

心脏瓣膜纤维化是一个长期的慢性形成过程[2]，目前尚不能复制动物模型，对瓣膜纤维化的研究只能依赖于临床样本，而原始样本的获得是非常有限的，并且它们之间存在着明显的个体差异，使实验难以被重复和验证。随着国内外对医学伦理学的重视，将原始临床样本用于研究的困难越来越大，在很大程度上制约了研究进程。采用心脏心肌组织作为研究对象获取间接实验证据尚不能反应瓣膜本身的病理机制，因此如果能获得心脏瓣膜替换手术患者纤维化瓣膜的疾病相关分子信息，尤其是有效地获得基因表达情况将能为瓣膜纤维化研究奠定重要的实验基础，但是国内外尚未见该方面的报道。本研究探索性地利用人类纤维化心脏瓣膜，克服纤维化瓣膜含有细胞及其遗传物质少的困难，以SMART技术(switching mechanism at 5’end of the RNA transcript)为基础，构建了高质量的纤维化瓣膜的噬菌体表达文库，为心脏瓣膜纤维化的分子机制研究奠定了重要的实验基础。

材料和方法

1 材料

心脏瓣膜来自我院心外科手术的风湿性心脏病患者纤维化心脏瓣膜组织，RNA提取试剂盒采用Qiagen公司的 RNeasy Plus Mini Kit，DNase I使用Qiagen公司的RNase－Free DNase Kit，使用Clontech公司的SMARTTMcDNA Library Construction Kit构建纤维化瓣膜组织噬菌体表达文库，λTriplEx2载体为Clontech产品，DNA聚合酶及其反应体系为TaKaRa产品，样本保存液购自TaKaRa。

2 方法

2.1 纤维化瓣膜组织总RNA的提取 手术取下的纤维化心脏瓣膜组织马上置样本保存液中，剪成约100－200 mg重的组织块，在液氮中用手工研钵研成粉沫，然后加入350 μL的RLT缓冲液充分混匀。将裂解液全速离心3 min，取上清加入g－DNA离心柱中，12 000 r/min离心30 s，保留收集管中的液体。向收集管的液体中加入1体积70%乙醇，混合后加入RNeasy离心柱，12 000 r/min离心15 s，弃掉流过液，在离心柱中心加入700 μL buffer RW1，离心柱中心加入500 μL buffer RPE，12 000 r/min 离心15 s，丢弃流过液，在离心柱中心加入500 μL buffer RPE，12 000 r/min离心2 min，弃掉流过液。在离心柱中心加入30－50 μL无 RNase的水，12 000 r/min离心 1 min，洗脱收集RNA，用DNase I去除残余的基因组DNA。用紫外分光光度计测RNA A260/A230及A260/A280，1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA的抽提质量及计算浓度。

2.2 纤维化瓣膜组织噬菌体展示文库的构建 文库的构建主要参照SMART cDNA Library Construction Kit操作程序并稍加改动。样本分别提取的总RNA合在一起，采用 Promega公司的 PolyATract mRNA Isolation System分离PolyA+RNA。

①第1链的合成 300 ng RNA与1 μL SMART IVTM Oligonucleotide(12 μmol/L)和 1 μL CDS III/3’PCR primer(12 μmol/L)混匀，72 ℃水浴2 min后冰浴2 min。向10 μL反应体系中分别加入2.0 μL 5× first－ strand buffer、1.0 μL DDT(10 mmol/L)、1.0 μL dNTP Mix(10 mmol/L)和 1.0 μL MMLV reverse transcriptase(2×108U/L)，42 ℃孵育1 h。

②用长距离PCR合成cDNA 在50 μL的反应体系中加入 7 μL first－ strand cDNA、1 μL 5’PCR primer(5' － AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT － 3')、1 μL CDSⅢ/3’PCR primer[5'－ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG － d(T)30N－1N － 3']、5 μL 10 ×Advantage 2 PCR buffer、1 μL 50 × dNTP Mix、1 μL 50×Advantage 2 Polymerase Mix 和 34 μL deionized H2O，进行PCR扩增，条件为95℃预变性20 s，95℃15 s，68 ℃ 8 min，共18 个循环。

③蛋白酶K消化和纯化 为了灭活DNA聚合酶的活性，在3 μg的双链cDNA和2 μL蛋白酶K(20 g/L)在45℃共同孵育20 min。消化产物按操作程序进行纯化，并用79 μL去离子水重悬沉淀。

④Sfi I酶切 为连接入λTriplEx2载体对双链cDNA进行Sfi I黏性末端酶切，100 μL反应体系中包括10 μL 10 × Sfi buffer、10 μL Sfi I和 1 μL 100 × BSA，50℃ 酶切2 h。

⑤cDNA片段的过柱分级收集 产物用CHROMA SPIN－400过柱分级收集cDNA，共收集15份，每份取3 μL行1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外下确定高峰度收集管，含有cDNA的前6个收集管合在一起，加入醋酸、糖原和－20℃预冷的95%乙醇置－20℃过夜后离心，小心弃去上清，用70%乙醇洗沉淀并真空干燥，加入7 μL去离子水溶解沉淀并保存在－20℃。

⑥cDNA连入 λTriplEx2载体 cDNA和 λTriplEx2载体以1∶10的比列进行连接，反应体系包括cDNA、λTriplEx2载体、连接反应缓冲液、T4 DNA连接酶、ATP和去离子水，16℃孵育过夜。

⑦λ噬菌体的包装 连接产物和25 μL包装蛋白在30℃孵育90 min后再加入25 μL包装蛋白，30℃孵育90 min，然后加入 500 μL噬菌体缓冲液，加入25 μL氯仿即得原始文库。

2.3 原始文库的鉴定 用LB/tetracycline培养基准备XL1－Blue工作平板，挑取大肠杆菌XL1－Blue单克隆菌落，接种到15 mL LB/MgSO4/maltose培养液37℃ 增菌培养过夜，至A600=2.0时离心收集细菌，加入7.5 mL 10 mmo/L MgSO4重悬细菌。从原始库吸出2 μL，用1×λ稀释缓冲液按不同比例稀释，各取 1 μL加入到 200 μL过夜培养的 XL1－Blue，37℃水浴15 min，加入3 mL已溶解预热至48℃的LB/MgSO4顶层琼脂混匀，铺在准备好的90 mm LB/MgSO4平板上，37℃倒置培养过夜。统计噬菌斑，计算出噬菌体滴度(103pfu/L)。

2.4 非扩增文库重组克隆比列的鉴定 从原始库吸出2 μL，加入3 mL已溶解预热至48℃的LB/Mg-SO4顶层琼脂混匀，顶琼脂中预先加入50 μL IPTG和50 μL X －gal(0.1 mol/L)，铺到直径90 mm LB/Mg-SO4平板上，计算白斑所占百分比。

2.5 cDNA重组插入片段的鉴定 根据克隆位点两端序列设计合成引物 1(5’－CTCCGAGATGGACGAGC－3’)和引物2(5’－TAATACGACTCACTATAGGG－3’)，挑取噬菌斑单克隆放入15 μL去离子水中，100℃ 加热10 min制备成DNA模板，进行PCR扩增，50μL反应体系中包括2×MightyAmp buffer 25 μL，引物 1 1.5 μL，引物2 1.5 μL，DNA 模板 5 μL，DNA 聚合酶1 μL，去离子水 27 μL，PCR 条件为95 ℃预变性1 min，95 ℃ 50 s，56 ℃ 50 s，72 ℃1 min，共35个循环。PCR产物行1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

结 果

1 RNA分析

各样本提取总RNA的A260/A280比值是2.0－2.1之间，260 nm处的紫外吸收度测定平均浓度为180 mg/L。用1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA可见2条明亮的条带，见图1，28S rRNA比18S rRNA明亮提示RNA分离过程中无降解或污染，5S rRNA在纯化回收柱中属滤过物质，所以该电泳图上看不到5S rRNA条带。因此证明从样本中分离的总RNA是纯净、完整和稳定的，可用于cDNA文库的构建。1%琼脂糖凝胶电泳显示了polyA+RNA涂布位于0.4－4.0 kb之间。因此说明获得了高质高量的总RNA。cDNA的质量对于构建高质量的cDNA文库非常关键，cDNA的质量受mRNA的影响。总RNA和mRNA的质量和完整性经紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳分析结果是满足文库构建要求的。

Figure 1.Identification of isolated RNA from fibrotic valves.M:DNA molecular marker;Lane 1:RNA isolated from fibrotic valves.图1 纤维化心脏瓣膜提取RNA的电泳鉴定

2 引物延伸产物的分析

用polyA+RNA合成第1链cDNA，然后全部体积的单链cDNA用来合成双链，从产物中取5 μL用琼脂糖凝胶电泳分析，双链cDNA的条带呈分散状，长度主要分布在0.2－3.0 kb。

3 cDNA片段的分级分析

为避免文库中含有太多较小插入和非插入性克隆，用CHROMA SPIN－400柱分级回收cDNA以去除小于500 bp和大于3 000 bp的cDNA片段，15个收集管中分别取样经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，有5个收集管中的cDNA片段符合要求，cDNA片段经富集、沉淀和去离子水重悬用于连接。

4 cDNA文库的分析

4.1 原始文库的滴度测定和重组率的鉴定 根据cDNA和λ噬菌体载体(1/10)的浓度比值测定非扩增文库即原始文库的滴度为8×109pfu/L。用X－gal分析重组克隆，平板上1 000个噬菌斑中有10个蓝斑，计算重组率为99%。

4.2 cDNA重组插入片段的鉴定 随机挑选16个噬菌斑用通用引物做PCR扩增。其中81.25%的外源基因(13/16)的PCR产物大于1.0 kb，18.75%的外源基因(3/16)小于1.0 kb，但全部插入片段大于0.5 kb，见图2。

Figure 2.Identification of cDNA inserted segments of fibrotic heart valve library.M:DNA molecular marker;Lane 1－16:cDNA inserted segments identified by PCR.图2 PCR鉴定纤维化心瓣膜噬菌体表达文库的外源基因插入片段

讨 论

瓣膜病是我国最常见的一种多发性心脏病，多表现为瓣膜的纤维化和钙化，可由风湿性、退行性和缺血性等多种病因引起，而瓣膜纤维化和钙化是最严重的结局，它在各年龄段上都有发生[3]，是危害最严重的瓣膜病之一[1，2]。

瓣膜纤维化以风湿性和老年性最为常见[1]。包括中国在内的发展中国家，尤其是地处亚热带地区的国家，风湿热、风湿性心脏病仍然是常见病、多发病[4，5]。其中风湿性心脏瓣膜病最为常见，一般认为是风湿热反复发作而导致自身免疫系统损害心脏造成的[6－8]。新近的研究表明，柯萨奇 B 组(B3、B4)病毒感染也可导致与风湿性心脏病相同的免疫损害，最终也表现为心脏瓣膜的纤维化和钙化[9，10]。在西方发达国家瓣膜性疾病主要是以老年性为主，随着我国人口老龄化，老年性疾病日益受到重视，其中，由退行性变所致的老年心脏瓣膜病逐渐增多，最终都表现为瓣膜的纤维化和钙化[11]。据统计，我国老年性退行性心脏瓣膜病的患病率为20%－25%，而且随着年龄的增加患病率也有所增高，在75岁以上人群中，瓣膜纤维化和钙化的患病率为37%[12，13]。

基因表达对生理和病理生理机制具有重要的作用，因此了解某一状态下基因的表达情况对理解正常和病理状态非常关键，也为发现新的疾病相关基因提供了新策略。但目前人们对心脏瓣膜的纤维化机制了解尚少，在研究中由于瓣膜样本难以获得，获得的样本基本处于纤维化的晚期，其细胞成份被大量的纤维组织所取代，因此材料来源受限成为造成心脏瓣膜纤维化分子机制研究的瓶颈之一。构建cDNA噬菌体表达文库是记录、保存、筛选功能基因和进行差异性功能表达的重要手段，cDNA文库也为获得感兴趣的基因发挥了非常重要的作用。

在本研究中，我们成功构建了高质量的纤维化心脏瓣膜组织噬菌体表达文库，经鉴定原始文库的滴度是8×109pfu/L，根据蓝白斑筛选重组的比列是99%，完全能够代表mRNA复杂性，一般来说1×106就能够代表mRNA复杂性了[14]。外源基因片段中81.25%的大于1 kb，18.75%在0.5－1.0 kb之间，大多数插入片段大于0.5 kb。通过该文库的构建，我们把有限的珍贵样本资源以一种可以有效重复使用的库的形式保留下来，方便于为之后的研究源源不断地提供材料，cDNA文库的构建为寻找相关基因和研究它们的功能奠定了基础，最重要的是噬菌体原始文库的构建使后继研究不受原始材料的限制。

评价一个cDNA文库的质量 ，主要是看该 cDNA文库的库容量和重组噬菌体中插入的cDNA片段长度。高质量cDNA文库的克隆数 (独立克隆数)一般要求大于1×106，并且重组率要求高于80%，而本实验所构建的cDNA文库未扩增时滴度8×109pfu/L，经蓝白斑鉴定重组率为99%，外源插入片段大小介于500－2 000 bp之间，其中81.25%大于1 kb，完全符合高质量文库要求。另外，cDNA的质量对于构建高质量cDNA文库非常关键，而cDNA的质量受mRNA的影响。本研究中，总RNA的A260/A280比值是2.0－2.1，从样本中分离的总 RNA是纯净、完整和稳定的，可用于cDNA文库的构建。1%琼脂糖凝胶电泳显示了polyA+RNA涂布位于0.4－4.0 kb之间，因此说明获得了高质高量的总RNA，为构建高质量的cDNA文库提供了保障。

本研究采用SMART专利技术所构建的文库具有明显的特点，如可以直接表达外源基因、便于蛋白和核酸等多种技术筛选目的基因、易获得稀有基因和全长基因等。

用SMART primer extension－PCR技术构建的cDNA噬菌体表达文库，易筛选出疾病全长基因cDNA克隆，为疾病功能基因组研究提供了有用资源。与含内含子的基因组cDNA不同的是，cDNA具有一个能够表达的开放阅读框，基因可以直接用于体外表达，根据目的基因的特点可以用相应配体或抗体进行方便的功能性筛选，可同时获得功能蛋白及其编码基因，因此cDNA噬菌体表达文库不仅可以用来筛选目的基因，也可以用于表达这些基因。

Maniatis的早期工作为cDNA文库用于分子和基因组研究奠定了基础，从此cDNA文库的构建成为基因组学研究最基本和最重要的工具之一。噬菌体表达cDNA文库的构建可以用来寻找疾病相关基因和感兴趣蛋白。例如，从病人提取的mRNA逆转录来的单链cDNA可以与正常对照的cDNA文库进行杂交，剩下的cDNA可以作为削减cDNA探针来筛选疾病样本的cDNA文库来获得同源性克隆。也可以用特定疾病相关抗体或相互作用的分子配体作为免疫探针，对表达文库进行免疫筛选，从而获得具有生理或疾病相关功能的蛋白及其编码基因片段甚至全长。

另一方面，cDNA文库除能被用于鉴定感兴趣的基因，也可以为全长基因的克隆提供材料。对cDNAs的研究仍然是诠释基因结构和功能的一种重要手段，获得全长和完整的cDNA文库在程序上仍然具有挑战性。本研究采用了Clontech公司的SMART专利技术，在原理上只有含全长mRNA及SMART寡核苷酸的模板才能在PCR反应中扩增出来，因此，用此技术构建cDNA文库与其它文库构建方法相比，可以消除基因组DNA或polyA－RNA对文库的污染，能以少量(少至50 ng)总RNA选择性地扩增出全长cDNA，建立高质量、高重组率的全长cDNA文库。

因此，虽然与疾病相关的cDNA在公共数据库里是有限的，而cDNA文库的构建和基因克隆方法的改进将有助于研究特定条件下表达基因的克隆和鉴定，也将有利于进一步阐明疾病和病原相互作用的分子机制。

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