HDL3抗脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤*

桑 慧， 姚树桐， 杨娜娜， 司艳红， 于凤秀， 商战平， 秦树存，△

(泰山医学院 1病理生理学教研室，2动脉粥样硬化研究所，山东泰安271000)

血管内皮损伤是动脉粥样硬化等心血管疾病发病的重要环节。革兰氏阴性细菌外膜成份脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)进入血液循环后，可启动炎症反应，刺激大量炎症因子合成释放，趋化炎症细胞并促使其向血管内皮细胞黏附聚集，进而导致血管内皮受损，功能紊乱。流行病学调查表明心血管疾病与高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)水平降低密切相关。HDL是血液中密度最高、颗粒最小的一种脂蛋白，其抗炎活性、胆固醇的逆向转运及抗氧化活性已成为心血管疾病预防的重要靶点[1]。内毒素血症时，HDL与 LPS结合，中和其活性，减少炎症介质的释放，显著改善LPS所致内毒素血症动物模型的损伤[2]。但HDL结构、代谢、功能具有高度异质性，超速离心将人HDL分离为HDL2(1 063-1 125 g/L)和 HDL3(1 125-1 210 g/L)两个亚群，HDL3接受胆固醇、酯化后转化为HDL2。蛋白质组学研究[3]表明 HDL3 富含 apoA-I、apoF、apoJ、apoL-I、PLTP、PON1、PAF-AH 和 LCAT，脂质组学研究[4]表明HDL3含有丰富的鞘氨醇-1-磷脂。炎症或脂质代谢异常时HDL2及中等大小的HDL明显降低，而HDL3水平无明显变化[5]。研究表明HDL3颗粒较 HDL2具有更强的抗氧化性[6]。因此在炎症、血脂代谢异常时HDL3抗动脉粥样硬化的作用至关重要[1，7]。本研究在LPS致人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)损伤模型上，研究富含apoA-I的HDL3对HUVECs炎症性损伤及核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)活化的影响，以进一步探讨HDL的抗炎机制。

材料和方法

1 材料

1.1 主要药品及试剂 人脐静脉内皮细胞株由南京凯基生物工程公司提供，LPS(E.coil O55∶B5)以及噻唑蓝(MTT)购自Sigma;RPMI-1640培养基及胎牛血清购自Gibco;0.25%胰蛋白酶购自Merck;Annexin-Ⅴ/碘化丙啶(propidium iodide，PI)双标记试剂盒购自BD;ELISA试剂盒购自RD;NF-κB p65抗体购自Santa Cruz;增强化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)试剂盒为 Pierce产品;2'，7'-二(2-羧乙基)-5(6)-羧基荧光素乙酰氧甲基酯[2'，7'-bis(2-carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein acetoxylmethyl ester，BCECF-AM]为北京泛博生化产品;其它试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器 Sanyo CO2培养箱，Olympus倒置显微镜，721分光光度计，Bio-Rad 550酶标仪、流式细胞仪及电泳仪，Beckman超速离心机。

2 HDL3的提取制备

收集正常人新鲜血浆50 mL，根据文献[6]报道方法制备。用 NaBr调整血浆密度为1 006 g/L，于4℃、40 000 r/min离心24 h，去除上层白色絮状物即极低密度脂蛋白;以NaBr调整下层液体密度为1 063 g/L，相同条件下离心48 h，取出上层淡黄色液体后，再以NaBr调整下层液体密度为1 125 g/L，相同条件下离心48 h，取出上层淡黄色液体即HDL2。继续以NaBr调整下层液体密度为1 210 g/L，相同条件下离心48 h，取出上层淡黄色液体即HDL3。将HDL3装入透析袋用含0.1%EDTA的 PBS透析24 h，0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌，4℃ 保存备用。BCA试剂盒定量蛋白，调蛋白浓度至1 g/L用于实验。

3 HUVECs的培养及分组

HUVECs株复苏后，用含10%胎牛血清RPMI-1640培养液在37℃、5%CO2培养箱孵育，选用对数生长期细胞用于实验。实验分5组:(1)对照(control)组:正常培养的 HUEVCs;(2)LPS组:1 mg/L的LPS作用6 h;(3)HDL3+LPS组:分别用50 mg/L(HDL3-50)、100 mg/L(HDL3-100)和200 mg/L(HDL3-200)HDL3预孵育HUVECs 18 h后加入1 mg/L LPS作用6 h。

4 检测指标

4.1 HUVECs活力测定 采用MTT比色法检测。常规消化，调整细胞密度为5×108/L，每孔加入200 μL单细胞悬液传至96孔板上，每组6孔。细胞贴壁后吸去培养基，根据分组进行处理;培养终止前4 h，每孔加入5 g/L MTT 溶液 20 μL，2 000 r/min 离心5 min，吸去上清液;加200 μL二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)振荡混匀30 min，使结晶完全溶解;全自动酶标仪上，以λ=490 nm，测吸光度值(absorbance，A)。

4.2 流式细胞仪检测细胞凋亡 常规消化，调细胞密度为5×108/L，将细胞传6孔板上，每孔加入1.5 mL，细胞贴壁后吸去培养基，根据分组进行处理。收集各组细胞并以PBS洗涤后，用Binding Buffer悬浮细胞，加入 5 μL Annexin V/FITC混匀，然后加入5 μL PI，混匀后室温避光反应15 min，用流式细胞仪(Ex=488 nm;Em=530 nm)上机检测细胞凋亡情况。实验重复4次。

4.3 单核细胞与HUVECs的黏附实验 在24孔板孔内培养HUVECs至80%汇合，根据分组进行处理。于实验结束前1 h标记THP-1细胞。将THP-1细胞离心洗涤2遍，加入含1 μmol/L的BCECF-AM的无血清RPMI-1640培养基，37℃避光孵育1 h，孵育结束后，离心去除未结合的BCECF-AM;RPMI-1640重悬标记后的THP-1细胞，密度为5×109/L。以RPMI-1640洗涤HUVECs 2次后，加入0.5 mL荧光标记的THP-1细胞，于37℃避光孵育1 h，孵育结束后，吸弃上清，PBS轻轻洗涤3次，去除未结合的THP-1细胞，在倒置荧光显微镜下观察。每孔采图4张，用Image-Pro Plus 6.0图像处理系统计数结合的THP-1细胞数。

4.4 ELISA法检测血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1)蛋白表达 收集各组细胞培养液上清，严格按照ELISA试剂盒操作步骤进行。用Bio-Rad 550型酶联免疫监测仪测量吸光度值A(λ=450 nm)，计算培养液中VCAM-1蛋白的量。

4.5 免疫细胞化学法检测NF-κB p65 将细胞接种于放有无菌盖玻片的6孔板中，细胞处理后，冷丙酮固定，按照SABC试剂盒说明操作:3%过氧化物酶灭活内源性过氧化氢酶;BSA封闭，滴加1∶200稀释兔抗NF-κB p65单克隆抗体，室温孵育2 h后加入生物素标记的山羊抗兔Ⅱ抗20 min;SABC溶液孵育15 min后DAB避光显色，蒸馏水冲洗;苏木素轻度复染，脱水，透明，封片。以PBS代替Ⅰ抗孵育作为阴性对照，以细胞核内或核周边出现棕黄色颗粒为阳性表达，每张爬片随机取4个视野、放大400倍采图，用Image-Pro Plus 6.0图像处理系统测量阳性染色部位的累积吸光度(integrated absorbance，IA)进行半定量分析。实验重复4次。

4.6 Western blotting检测NF-κB p65的表达 按照核蛋白提取试剂盒说明书提取细胞核蛋白，BCA法蛋白定量，将蛋白浓度调成一致，并加入5×上样缓冲液，沸水中5 min变性，置-80℃保存。取上述蛋白样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE，8%分离胶)电泳(上样量为 50μg)，将电泳分离后的蛋白质电转移至PVDF(polyvinylidene difluoride)膜上，经封闭、洗脱后加入兔抗人NF-κB p65单克隆抗体(1∶200)，4℃过夜，洗膜后以辣根过氧化物酶标记Ⅱ抗室温孵育1 h，并以兔抗β-actin(1∶8 000)单克隆抗体同上操作，作为上样内参。ECL显色，暗室 X光胶片曝光。采用 Image-Pro Plus图像分析软件分析蛋白条带的IA(IA=平均吸光度值×面积)，以靶蛋白IA值与β-actinIA值的比值反映靶蛋白相对水平。

5 统计学处理

结 果

1 HUVECs增殖活性的变化

正常对照组的吸光度值为0.689±0.043，LPS作用于HUVECs 6 h后细胞增殖活力降低(0.626±0.026)，与正常对照组比较降低了9.22%(n=6，P＜0.01);HDL3显著抑制LPS所致的细胞活力降低，其100 mg/L和200 mg/L预处理组A值(0.692±0.021和0.704±0.034)分别较LPS处理组增加了10.66%和12.61%(n=6，P＜0.01)，而与对照组无显著差异(n=6，P ＞0.05)。

2 HUVECs凋亡分析

正常对照组细胞凋亡率为2.32%±0.06%;LPS作用后细胞凋亡率(11.62% ±1.16%)较对照组明显上升(n=4，P＜0.01);HDL3预处理后细胞凋亡率明显降低，其100和200 mg/L HDL3预处理组细胞凋亡率分别下降至6.68%±0.78%和4.58%±0.62%，与LPS组比较有统计学差异(n=4，P＜0.05或 P ＜0.01)，见图1。

Figure 1.Annexin V/PI double staining was used to detect cell apoptosis by flow cytometry.Control:HUVECs;LPS:1 mg/L LPS+HUVECs;HDL3-50:50mg/L HDL3+1 mg/L LPS+HUVECs;HDL3-100:100mg/L HDL3+1 mg/L LPS+HUVECs;HDL3-200:200mg/L HDL3+1 mg/L LPS+HUVECs.图1 Annexin V/PI双标和流式细胞术检测细胞凋亡

3 单核细胞与HUVECs黏附的比较

在1 mg/L LPS作用6 h后，THP-1细胞与HUVECs黏附增加(P＜0.01)，较正常对照组增加2.77倍;HDL3预处理显著抑制LPS所诱导的THP-1细胞与HUVECs间的黏附，50、100和200 mg/L HDL3预处理后THP-1细胞黏附数量相对于模型组分别降低了31.84%、47.68%和53.53%(P＜0.01)，且200 mg/L HDL3预处理后THP-1细胞黏附数量与正常对照相比无显著差异(P＞0.05)，见图2、3。

Figure 2.THP-1 cells adhenent to HUVECs were observed after HDL3 treatment under fluorescence microscope.Scale bar:250 μm.Control:HUVECs;LPS:1 mg/L LPS+HUVECs;HDL3-50:50 mg/L HDL3+1 mg/L LPS+HUVECs;HDL3-100:100 mg/L HDL3+1 mg/L LPS+HUVECs;HDL3-200:200 mg/L HDL3+1 mg/L LPS+HUVECs.图2 荧光显微镜下观察HDL3处理后THP－1细胞黏附于HUVECs变化

Figure 3.The numbers of THP-1 cells adherent to HUVECs after HDL3 treatment.±s.n=4.#P＜0.05，##P＜0.01 vs control group;＊＊P ＜0.01 vs LPS group.图3 HDL3处理后THP－1细胞黏附于HUVECs的数量分析

4 培养液中VCAM －1蛋白的改变

LPS是刺激黏附分子及炎症介质表达的有力的刺激因子，在它的作用下，VCAM-1蛋白表达增加，较正常对照增加1.53倍(P＜0.01);HDL3预处理可显著抑制VCAM-1蛋白表达上调，50、100和200 mg/L HDL3预处理后VCAM-1蛋白量分别较模型组降低了19.29%、25.19%和32.72%(P＜0.05或P＜0.01);200 mg/L HDL3预处理后VCAM-1蛋白与正常对照相比无显著差异(P＞0.05)，见图4。

Figure 4.Expression of VCAM-1 protein in media after HDL3 treatment.±s.n=4.#P＜0.05，##P＜0.01 vs control;*P ＜ 0.05，＊＊P ＜ 0.01 vs LPS group.Control:HUVECs;LPS:1 mg/L LPS+HUVECs;HDL3-50:50 mg/L HDL3+1 mg/L LPS+HUVECs;HDL3-100:100 mg/L HDL3+1 mg/L LPS+HUVECs;HDL3-200:200 mg/L HDL3+1 mg/L LPS+HUVECs.图4 HDL3处理后细胞培养液中VCAM －1蛋白表达的变化

5 NF－κB p65表达的检测

5.1 免疫细胞化学检测NF-κB p65的变化 胞核或胞浆出现棕黄色为阳性表达。对照组细胞核蓝染，胞浆着色不明显，即NF-κB p65表达较低;LPS刺激后不仅胞浆着棕黄色，大部分胞核也阳性表达，IA值与对照组相比差异显著(P＜0.01);而HDL3预处理后胞浆胞核着色随HDL3作用浓度的增高而逐渐减弱，IA值较模型组分别下降了26.24%、48.76%和60.56%(P＜0.05或P＜0.01)，见图5。

Figure 5.Expression of NF-κB p65 in HUVECs after HDL3 treatment examined by immunocytochemical staining.Scale bar:20 μm.图5 免疫细胞化学染色检测HDL3处理后NF－κB p65蛋白表达

5.2 Western blotting检测NF-κB p65的变化 正常对照组细胞核NF-κB p65表达水平较低;LPS刺激后核内NF-κB p65水平显著增高，较对照组增加14.92倍(P＜0.01);HDL3预处理则明显抑制NF-κB的激活，且呈浓度依赖性，其细胞核内NF-κB p65蛋白水平较模型组分别降低28.00%、68.35%和80.79%(P＜0.05或P＜0.01)，见图6。

Figure 6.Levels of NF-κB p65 in the nucleus of HUVECs in each group detected by Western blotting.±s.n=4.#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs control;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs LPS group.图6 Western blotting检测各组细胞核内NF－κB p65蛋白表达

讨 论

LPS是导致全身炎症反应的关键介质，进入机体后通过LPS结合蛋白，与CD14阳性细胞结合后，激活细胞内信号转导通路如NF-κB通路，导致炎性介质和细胞因子的过度释放，引发炎性瀑布反应[8]，趋化炎症细胞并促使其向血管内皮细胞黏附聚集，进而导致血管内皮受损，功能紊乱。本实验中1mg/L LPS作用于HUVECs后细胞增殖活性降低、凋亡数增加，VCAM-1分子表达增加，NF-κB p65向核内转移，表明LPS诱导HUVECs炎症性损伤。

HDL具有拮抗LPS所诱导的炎症作用，可与LPS结合，直接被肝细胞上的SR-B1受体结合而降解[9，10]，还可以通过 HDL 脂质转运、抗氧化作用移除或灭活炎症脂质，进而抵消 LPS的炎症介质作用[11]。但HDL是颗粒大小、密度、组成、功能极不均一的脂蛋白，HDL3相对于HDL2体积小、胆固醇含量低而蛋白含量高。炎症或血脂异常时，HDL结构改变，胆固醇含量减少而甘油三酯增加，这种HDL颗粒apoA-I结合松、易脱落，结果循环中HDL2及中等大小的HDL明显降低，而HDL3颗粒水平相对稳定[5]。富含甘油三酯的HDL2颗粒向肝细胞转运胆固醇功能也受到影响，HDL介导的胆固醇转向了巨噬细胞[7]。因此炎症时HDL3颗粒承担了主要的抗炎作用。

本实验中HDL3预处理HUVECs可显著恢复细胞活力，且呈浓度依赖性。AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡，进一步证实HDL3预处理可以减轻LPS对血管内皮细胞的损伤作用。与Ashby等[12]报道HDL3抑制 VCAM-1的表达一致，我们发现经HDL3处理18 h后，VCAM-1的表达降低，单核细胞与内皮细胞黏附减少。Thaveeratitham等[13]证明贫脂HDL能显著抑制LPS诱导的白细胞黏附，而脂质成分却没有此效应，因此HDL3减轻LPS的损伤作用与HDL3蛋白含量密切相关。LPS的生物学活性中心lipidA的结构非常保守，是LPS分子中最稳定的部分，HDL与LPS结合时LPS的 lipidA插入到HDL分子外壳的磷脂层，有效地封闭LPS的活性中心。HDL3抑制黏附分子表达的能力不仅与HDL3内丰富的载脂蛋白如apoA-I、apoA-IV有关，还与HDL3中存在的磷脂，如鞘氨醇-1-磷脂、磷酯胆碱有关[3，4，9，12]。

NF-κB是已知的调控VCAM-1等炎症因子表达的诱导型核转录因子，静息状态下多以p50和p65二聚体与其抑制蛋白IκB相结合而存在于胞浆中，呈无活性状态。当细胞受到LPS、氧化应激等外源性刺激后，通过信号转导引起IκB降解，导致NF-κB-IκB复合物解体，NF-κB活化进入细胞核，与靶基因特异序列结合并启动转录，介导诸多炎症介质如 VCAM-1、TNF-α、IL-1、IL-6 等过度表达，进而引起炎症细胞黏附聚集，导致组织细胞级联放大的炎症损伤反应[14]。本实验免疫细胞化学染色及Western blotting检测均表明HDL3预处理可抑制NF-κB p65向细胞核中转移，进一步证实HDL3降低了LPS介导的炎症反应。尽管有报道[15]HDL在急性炎症反应时，可转化为促炎介质，但本实验中的得到的数据仍支持HDL的抗炎作用，其中HDL3可能起了决定性的作用。

综上所述，HDL3可通过抑制NF-κB所介导的炎症反应减轻HUVECs损伤。但有关HDL3抗炎机制的研究尚需从其结构组成进一步深入探讨。

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