携带红色荧光蛋白报告基因的重组腺病毒载体的构建及其体外试验研究*

卢建溪， 阳 莉， 钱师宇， 王 强

(1中山大学附属第三医院疫苗研究所，广东广州510630;2暨南大学医学院，广东广州510632)

报告基因是指一组编码易被检测的蛋白质或酶的基因，可通过报告基因的表达产物来“报告”目的基因的表达调控，作为一种灵敏度高、检测简便、结果可靠的技术手段，已广泛应用于基因表达调控、细胞信号转导、示踪等分子生物学和细胞生物学研究领域。目前，用于医学研究的荧光蛋白主要有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)和红色荧光蛋白(red fluorescent protein，RFP)两种，但RFP的应用远没有GFP广泛。RFP是1999年由Matz等[1]从珊瑚虫体内分离出来的荧光蛋白，因其与GFP同源，可与GFP系列荧光蛋白共用，而且激发和发射波长更长，细胞内成像背景低，而被迅速关注。RFP对GFP是一种很好的代替和补充，为细胞内基因表达多荧光标记提供了更多的荧光标签[2，3]。因此，本研究构建了携带红色荧光蛋白报告基因的重组腺病毒载体，并在体外测试其对肿瘤细胞的感染效率，以期为基因治疗与基因疫苗研究提供另一种检测工具。

材料和方法

1 材料

1.1 细胞与菌种 AD293细胞为本研究所保存。DH5α和Stbl2菌种购自Invitrogen。

1.2 质粒 pShuttle－CMV、pTurboRFP－N 和 pH5'040.pkGFP－II为本研究所保存。

1.3 主要试剂 DMEM培养基(Gibco);Lipofectamine 2000脂质体转染试剂(Invitrogen);特级胎牛血清(Hyclone);限制性内切酶及连接酶(TaKaRa);凝胶回收试剂盒、纯化试剂盒及质粒小提试剂盒(Omega);质粒中量制备试剂盒(Qiagen)。

1.4 主要仪器 微量台式离心机(Beckman)，核酸蛋白分析仪(Beckman)，荧光倒置显微镜(Nikon)，二氧化碳培养箱(Herarus)，生物安全柜(Thermo)，超低温冰箱(Thermo)，电泳仪(上海天能科技公司)凝胶成像分析系统(Bio－Rad)。

2 方法

2.1 携带目的基因的腺病毒穿梭质粒pShuttle－TurboRFPN的构建 用核酸内切酶Nhe I和Not I分别双酶切携带目的基因RFP的质粒pTurboRFP－N和腺病毒穿梭质粒pShuttle－CMV，将酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳后，切胶分别回收796 bp的目的基因RFP片段和线形的腺病毒穿梭质粒pShuttle－CMV片段。用T4 DNA连接酶连接这2个片段，将纯化后的连接产物转化到超级感受态DH5α细胞中，涂布于含卡那霉素(50 mg/L)的LB平板上37℃倒置培养16 h。挑选菌落扩增，试剂盒提取质粒，用Nco I和Not I双酶切鉴定筛选出含RFP基因的阳性克隆。

2.2 重组腺病毒载体 AdH5'.040.CMV.RFP － N 的构建用核酸内切酶I－Ceu I和PI－Sce I分别双酶切腺病毒穿梭质粒pShuttle－TurboRFP－N和骨架质粒pH5'040.pkGFPII，将酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳后，切胶分别回收含RFP基因的2 040 bp片段和31 873 bp骨架大片段。用T4 DNA连接酶连接这2个片段，构成重组腺病毒载体AdH5'.040.CMV.RFP－N，将纯化后的连接产物转化超级感受态Stbl2细胞，涂布于含氨苄青霉素(60 mg/L)的LB平板上37℃倒置培养16 h。在荧光显微镜下挑取无绿色荧光的菌落，经过BstXⅠ初步酶切鉴定，有1个克隆出现预期条带，该阳性克隆再经HindⅢ和EcoRⅠ/SalⅠ酶切进一步鉴定。筛选出的阳性克隆进行质粒中量制备，取12 μg的重组腺病毒载体AdH5'.040.CMV.RFP －N 用 PacⅠ酶切，使其完全线性化，暴露其反向末端重复序列(inverted terminal repeat，ITR)，用纯化试剂盒纯化酶切产物，置－20℃保存备用。

2.3 重组腺病毒载体AdH5'.040.CMV.RFP－N的包装和扩增 根据Lipofectamine 2000转染试剂盒的使用说明，将线性化的AdH5'.040.CMV.RFP－N 转染AD293细胞，转染前1 d，将AD293细胞接种于6孔板中。转染当天，换无抗生素培养基，待细胞70% －90%融合时，加入DNA/脂质体复合物，转染后4－6 h换完全培养基(含10%FBS，1%双抗)。在荧光显微镜下逐日观察RFP表达及细胞病变情况，至AD293细胞80%出现病变时收集细胞，在37℃水浴与－80℃超低温冰箱之间反复冻融3次，10 000×g离心10 min，收集上清即病毒液，置－80℃作为毒种保留。将上述毒种反复感染293细胞来扩增病毒，用CsCl2连续密度梯度离心法纯化病毒液，透析后分装。

2.4 重组腺病毒颗粒感染能力检测 取上清液感染融合度达70% －90%的AD293细胞，用完全培养基培养。观察红色荧光蛋白表达及细胞病变情况，检测重组病毒颗粒是否具有感染活性。

2.5 重组腺病毒的滴度测定 按Quantum公司提供的试剂盒说明书步骤，采用组织培养半数感染剂量(median tissue culture infectious dose，TCID50)法滴定重组腺病毒载体AdH5'.040.CMV.RFP－N的生物活性及滴度。

2.6 腺病毒载体体外感染肿瘤细胞 将人肺癌细胞系A549和乳腺癌细胞系MDA－MB－231按照5×104cells/well接种于 24 孔板中，24 h后将腺病毒 AdH5'.040.CMV.RFP－N和对照病毒AdH5.CMV.EGFP按照1 000 vp/cell的剂量感染接种的细胞，37℃、5%CO2培养，48 h后于倒置荧光显微镜下观察细胞感染效果并照相。10×物镜下随机选择3个不同视野，计算RFP和EGFP阳性细胞数及总细胞数，比较上述2种腺病毒对这2种肿瘤细胞的感染效率。本实验重复3次。

3 统计学处理

采用SPSS 13.0统计学软件分析，计量资料数据以均数±标准差(±s)表示。单变量配对资料之间的比较采用配对样本t检验。

结 果

1 重组腺病毒穿梭质粒pShuttle－TurboRFP－N的酶切鉴定

腺病毒穿梭质粒pShuttle－TurboRFP－N用核酸内切酶Nco I、Not I双酶切后，经过1%琼脂糖凝胶电泳结果可见3 817 bp和1 071 bp 2个片段，证明RFP基因成功克隆入腺病毒穿梭质粒pShuttle，见图1。

Figure 1.Identification of the vector pShuttle－TurboRFP－N.M:marker;Lane 1:the result of pShuttle－TurboRFP－N digested with Nco I and Not I.图1 质粒pShuttle－TurboRFP－N酶切鉴定

2 重组腺病毒载体AdH5'.040.CMV.RFP－N酶切鉴定结果

挑取无绿色荧光克隆进行质粒小量提取，经过BstXⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定正确。EcoRⅠ酶切可见1 079 bp目的基因片段，证明成功地构建了重组腺病毒载体AdH5'.040.CMV.RFP－N，见图2。

3 重组病毒载体在AD293细胞中的包装和扩增

脂质体介导线性化重组腺病毒质粒转染AD293细胞，于转染第2 d荧光显微镜下观察可见有RFP表达，转染后第10 d出现明显的细胞病变。表现为明显增大呈球形，细胞核变大、变圆、贴壁能力下降而易脱落。用AdH5'.040.CMV.RFP－N细胞裂解液感染AD293细胞，感染第2 d即可见明显的细胞病变及RFP表达，到第7 d出现明显病毒噬斑，说明在AD293细胞中成功包装并扩增出具有感染性的病毒颗粒，见图3。

Figure 2.Identification of the recombinant adenovirus vector AdH5'.040.CMV.RFP － N.M:marker;Lane 1:AdH5'.040.CMV.RFP － N was digested with EcoRⅠ;Lane 2:AdH5'.040.CMV.RFP － N was digested with BstXⅠ.图2 重组腺病毒载体AdH5'.040.CMV.RFP－N酶切鉴定

Figure 3.Infection of AD293 cells by the recombinant adenovirus AdH5'.040.CMV.RFP － N.A:AD293 cells;B:AD293 cells infected by primary supernatant of recombinant adenovirus AdH5'.040.CMV.RFP － N after cultured for 24 h(inverted fluorescence microscope，×200).图3 AdH5'.040.CMV.RFP －N 感染 AD293 细胞

4 重组腺病毒的滴度测定

扩增纯化后对获得的重组腺病毒载体采用TCID50法滴定重组腺病毒载体 AdH5'.040.CMV.RFP－N，其滴度为 1×1013pfu/L。重组腺病毒颗粒数为3.6×1015vp/L。

5 腺病毒体外感染肿瘤细胞

用腺病毒 AdH5'.040.CMV.RFP － N(1 000 vp/cell)和对照病毒AdH5.CMV.EGFP感染人肺癌细胞系A549和乳腺癌细胞系MDA－MB－231，48 h后于倒置荧光显微镜下照相，10×物镜下随机选取3个不同视野，通过计算RFP和EGFP阳性率来比较2种腺病毒对上述肿瘤细胞系的感染效果，见图4。经SPSS 13.0统计学软件分析表明:在CAR受体高表达的人肺癌细胞系A549中，腺病毒AdH5'.040.CMV.RFP－N对其感染效率(80.00%±2.65%)高于对照腺病毒(59.00% ±3.61%)，见图4A、B，P＜0.05。在 CAR低表达的乳腺癌细胞系 MDA－MB－231中，腺病毒 AdH5'.040.CMV.RFP－N对其感染效率(76.00% ±2.65%)高于对照腺病毒(51.00% ±1.73%)，见图4C、D，P ＜0.05 。

Figure 4.Comparison of infection efficiencies between AdH5'.040.CMV.RFP － N and AdH5.CMV.EGFP.A:A549 cells infected by AdH5'.040.CMV.RFP － N;B:A549 cells infected by AdH5.CMV.EGFP;C:MDA － MB －231 cells infected by AdH5'.040.CMV.RFP－N;D:MDA－MB－231cells infected by AdH5.CMV.EGFP.图4 腺病毒 AdH5'.040.CMV.RFP－N 和对照病毒AdH5.CMV.EGFP对肿瘤细胞感染效率的比较

讨 论

腺病毒感染滴度高、既可以感染分裂期细胞又可以感染非分裂期细胞、基因容量较大、外源基因表达水平高且蛋白质磷酸化和糖基化水平高，病毒基因组较少发生重排以及具有多种型别可供选择等优点，因此是目前基因研究普遍应用的载体[4－6]。随着分子生物学领域的迅猛发展，特别是重组DNA技术的建立，使得导入各种目的基因成为可能。本研究使用的pShuttle用于克隆目的基因，该穿梭质粒含有极罕见的2种内切酶酶切位点 PI－SceⅠ和 I－CeuⅠ，分别位于CMV启动子上游和PolyA尾下游，而且二者之间含有很多的克隆位点，可以方便地插入各种PCR产物或酶切产物。构建重组腺病毒时，只需将插入了外源基因的穿梭质粒用PI－SceⅠ/I－CeuⅠ双酶切后与经过同样酶切的腺病毒骨架质粒DNA连接，由于骨架质粒分子量较大，使其连接效率较低，这是技术上的难点。采用体外酶切连接的方法构建和制备表达RFP的重组腺病毒载体，比传统的细胞内同源重组方法[7]更为方便快捷，可使构建阶段最快1周完成，包括包装出重组病毒颗粒也只需3周时间，极大地缩短了实验时间，为快速高效地构建携带各种目的基因的重组腺病毒载体奠定了基础。

在基因治疗的研究中，评价重组腺病毒的基因转移效率、组织分布特点等，一般通过如 β－半乳糖苷酶基因(LacZ)、GFP基因等报告基因来进行检测和评价。目前，RFP的使用还远没有GFP广泛，与GFP相比RFP有如下优点[8－10]:(1)激发和发射波长较长，具有较高的信噪比，更易检测;(2)荧光的强度要比GFP的强度高得多;(3)对pH值不敏感，pH值为4.5－12.0时仍保持稳定。相信随着对RFP研究的深入，其使用范围会更加广泛，将成为人们进行科学研究的重要工具。

本研究采用体外连接法成功地构建了携带RFP基因的重组腺病毒载体AdH5'.040.CMV.RFP－N，将其转染AD293细胞后包装出重组腺病毒颗粒，感染AD293细胞后RFP得到了高效表达。在CAR受体高表达的人肺癌细胞系A549以及在CAR低表达MDA－MB－231肿瘤细胞系中，本研究所构建的重组腺病毒AdH5'.040.CMV.RFP－N对上述2种肿瘤细胞的感染效率均高于对照腺病毒AdH5.CMV.EGFP，其原因可能是RFP的荧光的强度要比GFP的强度高得多。上述研究结果表明RFP对GFP是一种很好的代替和补充，为RFP作为报告基因在基因治疗中的应用奠定了实验基础。

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