高血压病患者大网膜小动脉重塑的观测及相关蛋白表达探讨*

孙敬昌， 齐冬梅， 李运伦

(山东中医药大学1基础医学院细胞生物学实验室，2科技处，山东济南250355;3山东中医药大学附属医院心内科，山东济南250011)

血管重塑是血管对血液动力学或体液因素等的改变而发生的适应性变化，它构成了高血压并发症及循环紊乱的病理生理基础，主要病理表现为血管壁细胞成分增殖和凋亡的失衡以及细胞外基质的沉积。目前对高血压血管重塑的研究多集中在外周血管，对大网膜小动脉的重塑状况研究较少。本文旨在评价高血压患者大网膜小动脉重塑以及相关蛋白的表达状况，力求通过多窗口、全方位识别高血压血管病变，从而为防治高血压心脑血管事件提供依据。

材料和方法

1 材料

1.1 研究对象 以高血压病患者和非高血压病对照者大网膜中的小动脉为研究标本。标本采集方法:取外科急腹症手术切除、废弃的大网膜组织，取其中的小动脉，固定备用。

1.2 主要试剂 即用型SABC免疫组化检测试剂盒、亲和纯化Bax鼠单抗IgG和亲和纯化Bcl-2鼠单抗IgG、亲和纯化c-Myc鼠单抗IgG和亲和纯化c-Fos兔多抗IgG购自武汉博士德生物工程有限公司;MMP-9鼠单抗IgG和TIMP-2鼠单抗IgG购自北京中杉金桥生物制品有限公司;生物素化山羊抗兔IgG和DAB显色剂购自武汉博士德生物工程有限公司。

2 方法

2.1 分组 高血压病患者组和非高血压病对照者组。高血压病组患者符合WHO/ISH的高血压诊断及分级标准，不伴有冠心病、糖尿病、高脂血症等，长期或间断服用降压药物。

2.2 观测指标及检测方法

①血压测量 参照2003年《中国高血压防治指南》的测量方法。

②血液流变学参数检测 采用锥板式稳态测量方法，观察全血黏度低切(whole blood viscosity low cut，WBV-LC)、全血黏度中切(whole blood viscosity cut，WBV-MC)、全血黏度高切(whole blood viscosity high cut，WBV-HC)、毛细管血浆黏度(capillary plasma viscosity，CPV)、红细胞压积 (hematocrit，HCT)、血沉(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、全血还原黏度低切(whole blood reduction viscosity low cut，WBRV-LC)、全血还原黏度中切(whole blood reduction viscosity middle cut，WBRV-MC)、全血还原黏度高切(whole blood reduction viscosity high cut，WBRV-HC)和纤维蛋白降解产物(fibrin degradation product，FDP)等参数。

③大网膜小动脉形态学检测 将摘取的大网膜的小动脉用10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，将血管横切成厚度7 μm的薄片，HE染色，用光学显微镜观察，并用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统测量、计算大网膜小动脉中膜厚度与管腔直径的比值。

④大网膜小动脉Bcl-2、Bax、c-Myc、c-Fos、MMP-9、TIMP-2蛋白表达的检测 采用免疫组织化学SABC法，结果以HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统进行分析，每张切片任选5个视野测量积分吸光度，取均值作为该样本的蛋白相对表达量。⑤大网膜小动脉胶原含量的比较 采用Masson染色法。

3 统计学处理

采用SPSS 10.0进行双样本t检验，数据以均数±标准差(±s)表示。

结 果

1 2组血压比较

纳入研究的高血压病患者和非高血压病对照者各12例，分析比较高血压病患者组和非高血压病对照者组的血压状况，显示2组的收缩压和舒张压均有显著差异(P＜0.01)，说明纳入研究的对象符合设计要求，见表1。

表1 2组血压比较Table 1.BP comparison between two groups(mmHg.±s.n=12)

表1 2组血压比较Table 1.BP comparison between two groups(mmHg.±s.n=12)

＊＊P ＜0.01 vs normal group.

Group SBP DBP Normal 125.7±12.6 81.2±8.9 HBP 162.5 ±14.0＊＊ 97.6 ±9.3＊＊

2 2组血液流变学参数比较

高血压病患者组血液流变学参数较非高血压病对照者组有不同程度升高，尤以纤维蛋白原升高明显，表明高血压病患者组存在血液流变学异常，血液处于浓、黏、聚、凝状态，见表2。

表2 2组血液流变学比较Table 2.Comparison of hemorheology between two groups(±s.n=12)

表2 2组血液流变学比较Table 2.Comparison of hemorheology between two groups(±s.n=12)

*P＜0.05 vs normal group.

Group WBV-LC WBV-MC WBV-HC CPV HCT(%) ESR(mm/h) WBRV-LC WBRV-MC WBRV-HC FDP(g/L)Normal 8.97±1.89 5.83±2.01 5.25±1.17 1.34±0.41 44.34±5.47 15.17±6.64 16.48±4.03 10.91±3.17 8.32±2.17 2.16±0.45 HBP 10.49±4.70 6.43±1.37 5.95±2.10 1.39±0.36 43.20±7.87 15.90±7.95 18.90±6.36 13.17±4.06 9.11±2.59 4.97±0.87*

3 2组血管形态学比较

3.1 2组病理学比较 与非高血压病对照者相比，高血压病患者大网膜小动脉管壁有不同程度增厚，其中膜平滑肌细胞肥大、增生，弹力纤维排列紊乱，胶原纤维增生。可见高血压病患者大网膜组织的小动脉存在血管损害和纤维组织重塑，见图1。

Figure 1.Comparison of pathological changes(HE staining，×100).A:normal group;B:HBP group.图1 2组病理比较

3.2 2组体视学比较 高血压病患者组大网膜小动脉中膜厚度/管腔直径的比值较非高血压对照者显著增大(P＜0.05)，提示高血压病患者大网膜的小动脉存在血管重塑，见表3。

4 2 组大网膜小动脉 Bcl－2、Bax、c－Myc、c－Fos、MMP－9和TIMP－2蛋白表达的比较

高血压病患者组大网膜小动脉Bcl-2、Bax、c-Myc、c-Fos、MMP-9 和 TIMP-2 积分吸光度均较非高血压病对照者显著升高(P＜0.05)，表明在高血压病患者大网膜的小动脉 Bcl-2、Bax、c-Myc、c-Fos、MMP-9和 TIMP-2蛋白表达上调，见表4、图2。

表4 2组大网膜小动脉 Bcl－2、Bax、c－Myc、c－Fos、MMP －9和 TIMP －2表达的比较Table 4.Comparison of Bcl-2，Bax，c-Myc，c-Fos，MMP-9 and TIMP-2 protein expression in omental arterioles between the two groups(±s.n=12)

表4 2组大网膜小动脉 Bcl－2、Bax、c－Myc、c－Fos、MMP －9和 TIMP －2表达的比较Table 4.Comparison of Bcl-2，Bax，c-Myc，c-Fos，MMP-9 and TIMP-2 protein expression in omental arterioles between the two groups(±s.n=12)

*P＜0.05 vs normal group.

Group Bcl-2 Bax c-Myc c-Fos MMP-9 TIMP-2 Normal 24.60±7.32 18.50±5.71 14.14±5.15 74.40±7.97 289.00±7.55 58.80±7.98 HBP 51.32±8.33* 30.87±6.13* 48.31±9.46* 144.40±10.86* 387.80±12.32*159.50±12.36*

Figure 2.Comparison of Bcl-2，Bax，c-Myc，c-Fos，MMP-9 and TIMP-2 protein expression(immunohistochemical staining，×400).A1-A6:Bcl-2，Bax-2，c-Myc，c-Fos，MMP-9 and TIMP-2 protein expression in normal group，respectively;B1-B6:Bcl-2，Bax-2，c-Myc，c-Fos，MMP-9 and TIMP-2 protein expression in HBP group，respectively.图2 2组 Bcl－2、Bax、c－Myc、c－Fos、MMP －9及 TIMP －2蛋白表达比较

5 各组大网膜小动脉胶原含量的比较

非高血压病对照者大网膜小动脉壁存在胶原纤维表达，而高血压病患者大网膜小动脉壁胶原纤维增多，说明在高血压病患者大网膜小动脉壁存在较强的胶原纤维沉积现象，见图3。

表3 2组大网膜小动脉中膜厚度/管腔直径比值比较Table 3.Comparison of mid layer thickness/luminal diameter ratio in omental arterioles between the two groups(± s.n=12)

表3 2组大网膜小动脉中膜厚度/管腔直径比值比较Table 3.Comparison of mid layer thickness/luminal diameter ratio in omental arterioles between the two groups(± s.n=12)

*P＜0.05 vs normal group.

Group Media layer thickness/luminal diameter(×10-2)Normal 7.58±0.52 HBP 13.45±0.60*

Figure 3.Comparison of arteriolar collagen content(Masson dyeing，×100，grey is collagen).A:normal group;B:HBP group.图3 2组小动脉胶原含量的比较

讨 论

高血压血管重塑是一个漫长的过程，从内皮功能障碍、动脉粥样斑块形成，到最后粥样斑块破裂或脱落导致管腔完全闭塞引起急性心脑血管事件，大约需要十几年至数十年的时间。因此，全面识别高血压亚血管病变对于预防心脑血管事件具有重要意义[1]。病理学结合体视学观测在血管重塑的检测中发挥着重要作用。本研究应用病理学结合体视学观测大网膜小动脉的重塑状况，结果显示高血压病患者大网膜小动脉的管壁不同程度增厚，其中膜平滑肌细胞肥大、增生，弹力纤维排列紊乱，胶原纤维增生，中膜厚度/管腔直径的比值明显升高，从而说明高血压病患者大网膜小动脉存在血管重塑现象。

高血压血管重塑的发生机理复杂，有学者认为异常血流动力学改变参与了血管重塑的病理改变，是高血压动脉重塑的可能机制之一，血流速率的慢性改变引起血管口径改变，血压变化引起管壁厚度改变[2]。高血压状态下，因血管内流体静压升高，血管壁张力持续增强，可直接刺激血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖、肥大，管壁肥厚。本研究显示高血压患者存在血液流变学异常，血液处于浓、黏、聚、凝状态，表明血液流变学异常可能是高血压患者大网膜小动脉重塑的原因之一。

有研究表明，原发性高血压与血管平滑肌细胞的增殖加速与凋亡抑制失衡有关[3]。凋亡对于除去多余的有害或衰老细胞、调节细胞数量及维持组织构型具有重要意义[4]。现已明确，Bcl-2和Bax是调控细胞凋亡的一对重要蛋白。Bcl-2蛋白能抑制多种因素诱发的细胞凋亡[5]，其作用机制是直接或间接阻止细胞色素C自线粒体的释放，而后者可与三磷酸腺苷一起改变凋亡激活因子1(apoptosis activating factor-1，Apaf-1)的构型而使凋亡蛋白酶(caspase-9)激活，Bcl-2可直接与Apaf-1结合/或阻止细胞色素C释放，抑制caspases级联激活[6]。有研究显示，血压与Bcl-2浓度呈正相关，患者血清Bcl-2浓度随血压增高而升高，加速了血管平滑肌细胞的增生，抑制其凋亡[7]。Bax是促进细胞凋亡的蛋白之一，能够对抗Bcl-2蛋白抑制细胞凋亡的作用[8]，从而促进细胞凋亡。当Bax过表达时，形成同源二聚体，促进细胞凋亡，而Bcl-2过表达时形成异源二聚体，抑制细胞凋亡[9]。原癌基因c－fos是体内重要的编码核内转录因子，可编码核内多种信息分子，对细胞分化、增殖起重要作用，它的激活被认为是在血管损伤后VSMCs增殖的始动因素之一[10]。c－myc是一个功能广泛的核内癌基因，它表达的蛋白质为 c-Myc蛋白，c-Myc蛋白表达增高与VSMCs增殖和迁移密切相关，在一些致高血压因素作用下，c-Myc异常表达，促进 VSMCs增殖[11]。本研究发现高血压病患者大网膜小动脉Bcl-2、Bax、c-Fos和c-Myc蛋白表达上调，提示在高血压病患者大网膜小动脉壁存在平滑肌细胞凋亡、增殖的失衡，致使血管增殖肥厚，成为血管重塑的重要病理机制之一。

细胞外基质的代谢受基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)及基质金属蛋白酶抑制剂(tissue inhititor of metalloproteinases，TIMPs)调控，MMPs/TIMPs的动态平衡维持血管的正常功能[12]。MMPs是降解细胞外基质的关键酶，其中MMP-9又称明胶酶B，主要降解明胶、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型胶原及层黏连蛋白、蛋白聚糖及弹性蛋白等，能降解完整的基底膜[13]。TIMPs(如 TIMP-1、-2、-3、-4)是 MMPs的抑制物，能特异性地与MMPs催化活性中心的锌离子结合，而封闭其催化活性。本研究发现高血压病患者大网膜小动脉存在MMP-9和TIMP-2高表达，且TIMP-2增高幅度较MMP-9增高幅度大，提示MMP-9和TIMP-2表达失衡可能是高血压病患者大网膜小动脉重塑的原因之一。

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