MT1－MMP基因敲除细胞的诱导多能干细胞系的构建*

王彦霞， 马 玲， 马海英， 魏文娟， 卢晓梅， 金玉楠， 于艳秋

(中国医科大学基础医学院病理生理教研室，辽宁沈阳110001)

诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)是一类新型的干细胞，它有着与胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)相同的特征，具有自我更新、无限增殖以及向3个胚层分化的能力。ESCs属于全能干细胞，是来源于哺乳类动物囊胚的内细胞团，具有无限增殖而保持其多能性的能力，尤其在特定因素的影响或诱导下，可向多种细胞或组织分化[1，2]。通过将核转移到卵母细胞中[3]或成体细胞与ESCs相融合[4]，使成体细胞重新编程为具有多能性的细胞。但无论是ESCs还是重新编程的细胞在移植到病人体内都会发生免疫排斥反应，并且在获得ESCs时，不免会产生损坏胚胎的道德问题。最早建立iPSCs系是在2006年，研究人员利用逆转录病毒介导，将Oct3/4、Sox2、c－Myc及Klf4四个外源基因转入鼠成纤维细胞中，使成体细胞重新编程为具有多向分化潜能的干细胞，并命名该类细胞为 iPSCs[5，6]。在 2007年，美国Thomson实验室首次用Oct4、Sox2、Nanog及Lin28 4个基因转染，将人成纤维细胞重新编程为iPSCs[7]。到目前为止，国内外许多实验室完成了多种类型成体细胞向iPSCs的重新编程，同时iPSCs也可向多种组织类型细胞分化，如iPSCs能够定向分化为胰岛素分泌细胞、神经细胞、肝细胞和心肌细胞[8－11]等。膜型基质金属蛋白酶(membrane－type matrix metalloproteinases，MT－MMPs)可降解各种细胞外基质，通过控制细胞的黏附和细胞骨架的构建，调节细胞的迁移、生长、分化和存活[12]。它们依靠疏水性的C－末端锚定在细胞膜上，在细胞表面发挥水解作用[13]。MT1－MMP是最先被发现而且是最重要的，又称为MMP－14。MT1－MMP在血管与软骨、骨的形成中起着主要作用，特别是肿瘤中的血管。活化的MT1－MMP能降解细胞外各种基质大分子，包括Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型胶原、纤连蛋白、纤维蛋白等。在血管的形成过程中，内皮细胞首先侵入到主要由Ⅰ型胶原组成的间质性基质中，细胞外基质降解酶包括基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)在血管的形成中都起着重要作用，它们与细胞表面的结合位点结合后，依赖纤溶酶过程和/或MT1－MMP过程激活后而发挥作用。本实验是用转基因的方法将逆转录病毒介导的Oct3/4、Sox2、c－Myc及Klf4四个外源基因转入正常和MT1－MMP基因缺失鼠成纤维细胞中，使之重新编程为iPSCs，有利于我们进一步对MT1－MMP基因和iPSCs作用的研究。

材料和方法

1 材料

1.1 细胞来源 pMXs－Oct3/4、－Sox2、－c－Myc和 －Klf4质粒，Plat－ E 包装细胞系，Fbx15βgeo/βgeo鼠成纤维细胞，MT1 －MMP基因敲除鼠成纤维细胞和SNL饲养细胞等均由香港大学周中军教授馈赠。

1.2 主要试剂 DMEM(低糖)、胎牛血清(FBS)、0.25%trypsin－EDTA、L－谷氨酰胺、非必需氨基酸、青链霉素、OPTI－MEM、IMDM心肌诱导培养基和β－巯基乙醇均购自Gibco。羊抗鼠Flk－1/KDR多克隆抗体、rHuVEGF165和rHubFGF购自 R＆D Systems Inc.。PBS购自福州迈新公司。Lipofectamine 2000和DNA质粒提取试剂盒均购自Invitrogen。海美溴氨购自Sigma。明胶购自华美生物公司。鼠抗鼠或人SSEA－1单克隆抗体购自BioLegend。鼠抗鼠或人Oct3/4单克隆抗体、兔抗鼠troponin I多克隆抗体、山羊抗小鼠IgGPE、山羊抗兔IgG－PE和兔抗山羊 IgG－PE均购自 Santa Cruz。碱性磷酸酶试剂盒和DAPI均购自江苏碧云天公司。

2 方法

2.1 细胞准备 从液氮中各取出1管SNL、Plat－E、WT和MT1－MMP基因敲除细胞，放入37℃水浴锅中，使之快速解冻，然后将细胞悬液转移到离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，用含10%FBS的DMEM培养基重悬细胞，将细胞转移到提前铺好明胶的60 mm培养皿中，放在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养，等细胞长到约80% －90%融合进行传代。SNL细胞用丝裂霉素处理后，作为饲养细胞;Plat－E用于包装pMXs－Oct3/4、－Sox2、－c－Myc和－Klf4 4种质粒;WT和MT1－MMP基因敲除细胞准备被转染。

2.2 质粒扩增和包装成病毒 将分别携带有pMXs－Oct3/4、－Sox2、－c－Myc和－Klf4 4种质粒的大肠杆菌，加入到LB培养基中放入37℃摇床中过夜，第2 d用DNA提取试剂盒按说明书提取pMXs－Oct3/4、－Sox2、－c－Myc和－Klf4 4种质粒。

2.3 细胞转染 Plat－E包装细胞系传代后，以密度8×108cells/L细胞数接种于100 mm的培养皿中，加入OPTIMEM、Lipofectamine 2000和含有 pMXs－Oct3/4、－Sox2、－c－Myc和－Klf4的质粒过夜，第2 d 20 mL注射器吸取上清液，用0.45 μm滤器将上清液过滤到15 mL离心管中，再加入10 μL 8 g/L的海美溴氨。传代后的WT和MT1－MMP基因敲除细胞以密度8×107cells/L细胞数接种于100 mm的培养皿中，加入 pMXs－Oct3/4、－Sox2、－c－Myc和 －Klf4质粒包装成病毒的上清液，放入37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养，第2 d再转染1次，每天换液，2 d后传到铺有饲养细胞的培养皿中，隔天换液。

2.4 iPSCs的鉴定

①光镜下观察形态变化 在光学倒置显微镜下观察WT和MT1－MMP基因敲除细胞形态和转染后的克隆形成情况。当克隆足够大时，采集克隆，将克隆细胞传代，观察传代后iPSCs的形态。

②碱性磷酸酶染色 按碱性磷酸酶试剂盒说明书进行操作，将iPSCs以3×107cells/L密度接种于35 mm的培养皿中，第2 d弃去培养基，PBS洗2遍。4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3遍(每遍5 min)，加入碱性磷酸酶染色液，10 min后显微镜下观察拍照。

③免疫细胞化学染色 iPSCs用免疫细胞化学染色法检测ESCs特异性标志SSEA－1和Oct3/4表达情况。将iPSCs弃去培养基，PBS洗2遍，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3遍(每遍5 min)。0.2%Triton X－100打孔30 min，PBS洗3遍。5%FBA封闭样本20 min，滴加Ⅰ抗，置于湿盒，4℃孵育过夜，第2 d PBS洗3遍。滴加Ⅱ抗，37℃孵育30 min，PBS洗3遍。DAPI染核4 min，PBS洗3遍荧光显微镜下观察拍照。

2.5 体外iPSCs诱导分化和鉴定 用含20%FBS的IMDM心肌细胞诱导分化培养基，以及含有50 μg/L rHuVEGF和10 μg/L rHubFGF的内皮细胞分化培养基，iPSCs以密度8×107cells/L应用悬滴法(“hanging drop”)培养，即将细胞悬液以20 μL/滴，接种于盛有10 mL PBS的100mm培养皿的皿盖上，置37℃、5%CO2的孵箱中悬滴培养4 d后，iPSCs形成肉眼可见大小均一的拟胚体(embryonic bodys，EBs)。从单个悬滴中吸出形成的悬浮EBs，转入至预先以0.1%明胶包被的24孔培养板中(1－2个/孔)，隔天换1次新鲜诱导液，放入37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。分化约12 d后，向心肌细胞分化的一些EBs中，出现有节律跳动的心肌合胞体。心肌细胞出现跳动后，用免疫细胞化学染色法分别检测心肌细胞特异性标志物肌钙蛋白I和内皮细胞特异性标志物Flk－1表达情况。

结 果

1 WT和MT1－MMP基因敲除鼠成纤维细胞和Plat－E细胞形态

从液氮中各取出1管WT和MT1－MMP基因敲除鼠成纤维细胞和Plat－E细胞，快速解冻后，将这些细胞转移到提前铺好明胶的60 mm培养皿中，细胞长到约80% －90%融合后传代培养，可见2种成纤维细胞呈长梭形，见图1A、B，以及Plat－E细胞，见图1C。

Figure 1.The morphology of WT(A)，MT1－MMP－deficient(B)mouse fibroblasts and Plat－E cells(C)(×200).图1 WT和MT1－MMP基因敲除鼠成纤维细胞和Plat－E细胞形态

2 ESCs样克隆形成、iPSCs形态和碱性磷酸酶染色

在光学倒置显微镜下观察WT和MT1－MMP基因敲除细胞形态和转染后的克隆形成情况，可见有明显的ESCs样克隆形成，见图2A、D。当克隆足够大时，采集克隆，将克隆细胞传代，观察传代后iPSCs的形态，传代的iPSCs种在饲养细胞上，iPSCs与ESCs相似，呈集落式生长，见图2B、E。将传第3代的iPSCs进行碱性磷酸酶染色观察，可见iPSCs被碱性磷酸酶染成蓝紫色，见图2C、F。

Figure 2.The morphology of ESC－like clone(A，D)(×100)，iPSCs(B，E)(×200)and AP staining(C，F)(×200).A，B，C and D，E，F:cells derived from WT and MT1－MMP－deficient mouse fibroblasts，respectively.图2 ESCs样克隆形成、iPSCs形态和碱性磷酸酶染色

3 用免疫细胞化学染色检测ESCs特异性标志物SSEA－1和Oct3/4表达情况

传第3代的iPSCs用免疫细胞化学染色法检测ESCs特异性标志SSEA－1和Oct3/4表达情况，可见2种iPSCs都明显表达ESCs特异性标志物SSEA－1和Oct3/4，见图3。

Figure 3.Immunocytochemical analysis of WT－iPSCs(A －C，G－I)and MT1－MMP－deficient－iPSCs(D－E，JL).Expression of the pluripotency markers SSEA －1(A－F)and Oct3/4(G－L)was detected(×400).图3 免疫细胞化学染色检测ESCs特异性标志物SSEA－1和Oct3/4表达情况

4 体外iPSCs诱导分化培养EBs

从单个悬滴中吸出成形的悬浮EBs，转入至预先以0.1%明胶包被的24孔培养板中(1－2个/孔)，光镜下观察拟胚体，可见2种细胞被重新编程为iPSCs后，都可形成EBs，而且MT1－MMP基因敲除－iPSCs形成的EBs与WT－iPSCs形成的EBs形态一致，见图4。

Figure 4.The morphology of EBs derived from WT－iPSCs(A，C)and MT1－MMP－deficient－iPSCs(B，D)(×200).A，B:EBs induced to differentiate into EC-sC;C，D:EBs induced to differentiate into cardiomyocytes.图4 体外iPSCs诱导分化培养

5 已经形成的EBs肌钙蛋白I和Flk－1免疫细胞化学染色结果

将已经形成的EBs接种于提前铺好明胶的35 mm的小皿中，贴壁后用免疫细胞化学检测肌钙蛋白I和Flk－1的表达，可见MT1－MMP基因敲除－iPSCs形成的EBs能够表达肌钙蛋白I和Flk－1，与WT－iPSCs形成的EBs的表达情况一致，见图5。

Figure 5.Immunocytochemical staining of EBs derived from WT－iPSCs(A－C，G－I)and MT1－MMP－deficientiPSCs(D－F，J－L)induced to differentiate into ECs and cardiomyocytes(×400).Expression of the markers Flk－1/KDR(A－F)and troponin I(G－L)was detected.图5 2种iPSCs诱导分化为内皮和心肌细胞的EBs进行免疫细胞化学染色

6 单个内皮和心肌细胞肌钙蛋白I和Flk－1免疫细胞化学染色结果

将已经分化好的EBs用胰酶消化，吹打形成单个细胞后，接种于提前铺好明胶的35 mm的小皿中，贴壁后用免疫细胞化学检测肌钙蛋白I和Flk－1的表达，可见MT1－MMP基因敲除－iPSCs形成的EBs，吹打形成单个细胞后，也能够表达肌钙蛋白I和Flk－1，与WT－iPSCs的表达情况一致，见图6。

讨 论

目前iPSCs已经广泛被研究。2006年，研究人员将逆转录病毒介导的Oct3/4、Sox2、c－Myc及Klf4 4个外源基因转入鼠成纤维母细胞中，使成体细胞重新编程为具有多向分化潜能的干细胞[5，6]，即 iPSCs。通过 DNA 基因芯片分析，iPS细胞去甲基化状态与 ES细胞几乎相同[6]。iPSCs有着与ESCs相同的特性，但还具有ESCs没有的优点，iPSCs在临床应用中不涉及免疫和道德问题，而且可以根据病人及他们的病因不同，制备出以病人和/或疾病为特异性的iPSCs。现已有实验室将iPSCs定向分化而来的造血前体细胞，移植给致死量照射处理后的小鼠，结果发现不仅重建了小鼠的造血系统，而且将红细胞形态由原先的镰刀状修正为圆盘状[14]，这就说明了iPSCs将来可以运用于临床的疾病治疗中。

Figure 6.Immunocytochemical staining of single cells derived from WT－iPSCs(A－C，G－I)and MT1－MMP－deficient－iPSCs(D －E，J－L)induced to differentiate into ECs and cardiomyocytes(×400).Expression of the markers Flk－1/KDR(A－F)and troponin I(G －L)was detected.图6 EBs吹打为单个内皮和心肌细胞进行肌钙蛋白I和Flk－1免疫细胞化学染色

本实验通过逆转录病毒介导的Oct3/4、Sox2、c－Myc及Klf4四个外源基因转入到正常鼠的成纤维细胞中，将其重新编程为iPSCs，而且在国内外首次将MT1－MMP基因缺失鼠的成纤维细胞重新编程为iPSCs。对已形成的2种iPSCs，本实验中所用的检测方法是根据ESCs所具有的特性进行的。首先用碱性磷酸酶染色，碱性磷酸酶显色是免疫组化显色的一种，是对iPSCs进行初步的一种检测。ESCs中有许多多能的基因，如 SSEA － 1、Oct3/4、Sox2、Klf4、c － Myc、Nanog 及Lin28等，本实验选取了SSEA－1和Oct3/4这2种多能的基因进行免疫荧光染色，并且将这2种多能的细胞向心肌和内皮细胞分化，以验证重新编程的iPSCs含有与ESCs有着相似的多能特性。基质金属蛋白酶是一类具有锌指结构的内肽酶家族，它能降解细胞外基质，因此它在组织重塑，肿瘤发展和血管形成中起着重要的作用。MT－MMPs是一种固有的跨膜蛋白，它含有MMPs所有特征性的蛋白结构域，MTMMPs有6种亚型。与正常小鼠相比，MT1－MMP基因缺失的小鼠，可以表现出胶原代谢的缺陷，血管新生的反应延迟，并且由于血管形成缺陷，继发引起骨化中心受损，从而导致骨形成障碍[15]。从MT1－MMP基因敲除鼠取下的血管，进行体外培养可以看到血管出芽生长缺陷，而从普通小鼠取下的血管，则可以看到血管正常出芽生长[16]。此外，MT1－MMP可能调节癌细胞诱导其血管生成的能力，表达MT1－MMP的肿瘤细胞生成迅速，并且能形成含血管丰富的肿瘤，MT1－MMP在肿瘤中的过表达进一步支持了它的亲血管活性[13]。因此，MT1－MMP在新生血管中起着必不可少作用。

无论是正常细胞还是肿瘤细胞，细胞外的蛋白成分似乎对其微环境起着决定作用。MT－MMPs是细胞膜上重要的一类亚家族，它们与多种酶相联系，调节着细胞外基质。MT1－MMP主要作用是调节血管形成和裂解基质成分，它与膜和胞浆内分子相互作用，控制着一些细胞的功能[12]。因此，MT1－MMP发挥作用的信号转导路线需要被进一步研究。本次实验将MT1－MMP基因敲除鼠的成纤维细胞重新编程为iPSCs，经过一系列的检测发现该iPSCs与正常鼠成纤维细胞重新编程为iPSCs有着相似的特征，它可以表达ESCs特异性的抗体SSEA－1和Oct3/4，将其诱导可以向心肌和内皮细胞分化。MT1－MMP基因敲除鼠血管、骨和软骨形成障碍，根据我们研究发现将其重新编程为iPSCs后，它可以在体外分化为内皮细胞。但是基因缺失在一定程度上是否可以重建;将MT1－MMP基因敲除鼠的iPSCs回输到MT1－MMP基因缺失鼠内，血管再生、骨和软骨生成情况是否有改善，还有待我们进一步研究。这就给我们新的启发，从某些基因缺陷所致疾病的病人身上取得一些成体细胞，将其重新编程为iPSCs，然后再重新输入到病人体内，那么他们的基因缺陷能否可以修正，病情能否有所改善，这些都是我们要进一步研究的问题。

[1]Thomson JA，Itskovitz－Eldor J，Shapiro SS，et al.Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts[J].Science，1998，282(5391):1145－ 1147.

[2]胡智兴，耿菊敏，梁道明.肝细胞生长因子促进人胚胎干细胞向神经前体细胞分化[J].中国病理生理杂志，2010，26(4):730 －736.

[3]Wilmut I，Schnieke AE，McWhir J，et al.Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells[J].Cloning Stem Cells，2007，9(1):3－ 7.

[4]Cowan CA，Atienza J，Melton DA，et al.Nuclear reprogramming of somatic cells after fusion with human embryonic stem cells[J].Science，2005，309(5739):1369 －1373.

[5]Takahashi K，Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J].Cell，2006，126(4):663 － 676.

[6]Okita K，Ichisaka T，Yamanaka S.Generation of germline－ competent induced pluripotent stem cells[J].Nature，2007，448(7151):313－ 317.

[7]Yu J，Vodyanik MA，Smuga－ Otto K，et al.Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells[J].Science，2007，318(5858):1917－ 1920.

[8]Tateishi K，He J，Taranova O，et al.Generation of insulin－secreting islet－like clusters from human skin fibroblasts[J].J Biol Chem，2008，283(46):31601 －31607.

[9]Okano H.Strategies toward CNS－regeneration using induced pluripotent stem cells[J].Genome Inform，2009，23(1):217－ 220.

[10]Gai H，Nguyen DM，Moon YJ，et al.Generation of murine hepatic lineage cells from induced pluripotent stem cells[J].Differentiation，2010，79(3):171 － 181.

[11]Mauritz C，Schwanke K，Reppel M，et al.Generation of functional murine cardiac myocytes from induced pluripotent stem cells[J].Circulation，2008，118(5):507 －517.

[12]Zucker S，Pei D，Cao J，et al.Membrane type － matrix metalloproteinases(MT－MMP)[J].Curr Top Dev Biol，2003，54:1 －74.

[13]Hotary KB，Allen ED，Brooks PC，et al.Membrane type I matrix metalloproteinase usurps tumor growth control imposed by the three － dimensional extracellular matrix[J].Cell，2003，114(1):33－ 45.

[14]Hanna J，Wernig M，Markoulaki S，et al.Treatment of sickle cell anemia mouse model with iPS cells generated from autologous skin[J].Science，2007，318(5858):1920－ 1923.

[15]Zhou Z，Apte SS，Soininen R，et al.Impaired endochondral ossification and angiogenesis in mice deficient in membrane － type matrix metalloproteinase I[J].Proc Natl Acad Sci USA，2000，97(8):4052－4057.

[16]Chun TH，Sabeh H，Ota I，et al.MT1－MMP– dependent neovessel formation within the confines of the three － dimensional extracellular matrix[J].J Cell Biol，2004，167(4):757－ 767.