SnoN对高糖诱导大鼠原代肾小管上皮细胞纤维连接蛋白合成的影响*

刘瑞霞， 郭 兵， 王圆圆， 肖 瑛， 石明隽， 张国忠

(贵阳医学院病理生理学教研室，贵州贵阳550004)

我们前期研究发现，核转录共抑制因子SnoN(Ski－related novel protein N)在糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)肾小管－间质纤维化发病过程中可能起着重要作用[1－3]。但在 DN 发病中，有关SnoN与肾小管－间质纤维化之间存在怎样的关系，与肾小管－间质纤维化的哪些成份有关，国内外尚未检索到相关的报道。纤维连接蛋白(fibronectin，FN)是细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的主要成份，而ECM的过度沉积是DN肾小管－间质纤维化的基本病理改变。因此，我们通过动态观察SnoN和FN在高糖培养大鼠原代肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cells，RTECs)中的表达变化;并通过siRNA技术敲低肾小管上皮细胞中SnoN的表达，再观察FN的表达情况，初步探讨SnoN与DN肾小管－间质纤维化发病的关系。

材料和方法

1 材料

1.1 主要试剂 低糖DMEM培养基和胰蛋白酶(HyClone);胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(Gibco);转铁蛋白(Sigma);抗 SnoN、SnoN siRNA、siRNA transfection reagent、fluorescein － conjugated control siRNA、siRNA transfection medium、siRNA dilution buffer、SnoA/N(m)－PR和抗上皮性钙黏蛋白(E－cadherin)(Santa Cruz);抗角蛋白－18(cytokeratin－18，CK－18)、抗 α－平滑肌肌动蛋白(α－smooth muscle actin，α －SMA)、抗 FN、抗 β －actin、DAB、浓缩型SABC－FITC免疫检测试剂盒、生物素标记羊抗兔IgG和生物素标记羊抗小鼠IgG(博士德);总RNA提取试剂盒、蛋白质marker、2×Taq PCR Master Mix和600 bp DNA marker(天根);PVDF膜和3 mm Whatman滤纸(Millipore);RevertAidTMFirst Strand cDNA SynthesisKit(Fermentas);ECL显色剂(Pierce)。

1.2 动物 雄性 Sprague－Dawley(SD)大鼠，清洁级，鼠龄20 d，由贵阳医学院实验动物中心提供。

2 方法

2.1 大鼠原代RTECs培养 SD大鼠股动脉放血处死后无菌取肾，分离、剪碎肾皮质，80目、100目网筛分离肾小管节段;加入0.25% 胰蛋白酶，37℃水浴消化25 min;不含血清的培养基终止消化，生理盐水洗3次，离心弃上清;加入含有10%FBS的低糖DMEM培养液，接种于25 cm2培养瓶中，置37℃、5%CO2孵育箱培养。72 h后全量更换培养液，生长近融合时以1∶2传代，经鉴定为RTECs后继续培养，实验采用第3代细胞。

2.2 实验分组 细胞生长融合至约90%时，换无血清DMEM培养基培养24 h，使细胞生长同步。将细胞分为(1)对照组:DMEM+2%FBS培养;(2)高渗组:19.5 mmol/L D－mannitol+DMEM+2%FBS培养;(3)高糖组:19.5 mmol/L D－glucose+DMEM+2%FBS 培养;每组设 30 min、2 h、12 h、24 h、48 h、72 h和96 h 7个时点进行观察。

2.3 siRNA转染及分组 第3代肾小管上皮细胞按2×108/L浓度接种于含10%FBS、无抗生素的低糖DMEM培养液的6孔细胞培养板中，使得在转染当天细胞达到60% －80%融合;分为:(1)对照组:DMEM(含糖5.5 mmol/L)+2%FBS培养;(2)高糖组:19.5 mmol/L D－glucose+DMEM+2%FBS培养;(3)control siRNA组:转染 control siRNA，24 h后换为19.5 mmol/L D－glucose+DMEM+2%FBS培养;(4)SnoN siRNA组:转染SnoN siRNA，24 h后换为19.5 mmol/L D－glucose+DMEM+2%FBS培养。转染步骤按试剂盒操作说明进行，重复3次实验。

2.4 免疫荧光和免疫细胞化学 细胞爬片经4%多聚甲醛固定，0.5%Triton X－100打孔，3%H2O2去除内源性过氧化物酶，血清封闭后，分别加入抗CK－18(1∶100)，E － cadherin(1∶200)，FN(1∶50)和SnoN(1∶300)抗体，4℃孵育过夜。免疫荧光细胞化学加入生物素化Ⅱ抗(1∶100)，37℃孵育40 min;滴加 SABC －FITCⅢ抗(1∶100)，37 ℃孵育30 min，LEICA DMLS荧光显微镜观察并采集图像。免疫细胞化学加入生物素化Ⅱ抗(即用型)，室温下孵育40 min;滴DAB显色。PBS代替Ⅰ抗，作阴性对照。

2.5 Western blotting 加裂解液裂解细胞，离心取上清，BCA法测蛋白浓度。加样缓冲液变性蛋白，上样，经SDS－PAGE垂直凝胶电泳后，电转移至聚偏二氟乙烯 (polyvinylidene difuoride，PVDF)膜。5%脱脂奶粉室温封闭2 h，含0.05%Tween 20的TBS(TBST)冲洗后，用特异性抗体进行孵育，Ⅰ抗浓度如下:SnoN(1∶400)、FN(1∶100)、CK －18(1∶200)、E －cadherin(1∶200)、α － SMA(1∶100)和 β － actin(1∶400);4℃过夜。经TBST冲洗后加入辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗，室温孵育90 min。TBST冲洗，ECL显影曝光，Bio－Rad凝胶成像系统进行图像采集，Quantity One 4.6软件分析各阳性条带的积分灰度值，设内参照β－actin，计算各目标蛋白的相对表达量。

2.6 RT－PCR 采用Trizol试剂盒提取细胞RNA，琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性，核酸蛋白仪测定RNA的浓度和纯度。取3 μg逆转录合成cDNA，进行半定量PCR反应。PCR引物序列:SnoN(500 bp)上游引物5’－GAAAACCTCCAGTCTAAGTTCTCCTTAGTT－3'，下游引物 5’－ATGAAGCTGGTCTGAAGTACACCTTGAACA－3';相应 β－actin(306 bp)上游引物 5'－TGGCATTGTGATGGACTC －3'，下游引物 5'－CCGATAGTGATGACCTGAC－3'。FN(255 bp)上游引物 5'－GGACACTATGCGGGTCACTT－3'，下游引物 5'－TCAAAACCAGTTGGGGAGTC －3';相应β－actin(490 bp)上游引物5'－GAAATCGTGCGTGACATTAAG －3'，下游引物 5'－CTAGAAGCATTTGCGGTGGA－3'。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，Bio－Rad凝胶成像系统扫描，Quantity One 4.6软件分析各条带积分吸光度值，mRNA的相对表达量用目标mRNA/β－actin的积分吸光度值表示。

3 统计学处理

结 果

1 大鼠原代RTECs的鉴定

倒置显微镜下可见，体外培养的原代RTECs长势良好，第3 d即形成明显集落，形态呈典型的多边鹅卵石样，见图1。用上皮细胞的标志性蛋白E－cadherin和CK－18及间质细胞的标志性蛋白α－SMA对实验所用3代细胞进行鉴定。免疫荧光和Western blotting结果均显示，3代细胞E－cadherin和CK－18蛋白表达阳性，见图2，且几乎看不到α－SMA蛋白表达，见图3，说明培养细胞为大鼠原代RTECs。

Figure 1.The third day of primary culture(×400).图1 原代培养第3 d

Figure 2.Expressions of E －cadherin and CK －18 in primary cultured RTECs(SABC，×400).NC:negative control.图2 E－cadherin和CK－18在原代培养RTECs中的表达

Figure 3.Expressions of E －cadherin，CK －18 and α －SMA in primary cultured RTECs.图3 E－cadherin、CK－18和α－SMA在原代培养RTECs中的表达

2 不同处理组RTECs中SnoN蛋白表达

用高糖及甘露醇刺激大鼠原代RTECs 30 min－96 h，免疫荧光细胞化学和Western blotting检测SnoN蛋白表达。结果显示，RTECs胞浆和胞核均有SnoN表达，见图4;高糖刺激2 h SnoN蛋白表达减少(P＜0.05)，且呈时间依赖性;甘露醇刺激72 h出现SnoN蛋白表达减少，但仍显著高于高糖组(P＜0.01)，见图5。

3 FN蛋白和mRNA在不同处理组RTECs中的表达

免疫细胞化学染色结果显示，FN蛋白在RTECs中主要表达于细胞质，见图6。

Western blotting结果表明，与正常糖对照组相比，高糖培养原代RTECs 30 min FN蛋白表达即显著增多，持续至高糖培养96 h;高渗培养12 h出现FN蛋白表达增多，但仍显著低于高糖组，见图7。

Figure 4.Expression of SnoN protein in primary cultured RTECs after incubated with normal－glucose，mannitol and high－glucose medium(SABC，×400).NC:negative control;C:control;MO:mannitol;HG:high glucose.图4 不同条件培养原代RTECs中SnoN蛋白表达

Figure 5.Expression of SnoN protein in primary cultured RTECs after incubated with normal－glucose，mannitol and high－glucose medium at different time points.*P ＜ 0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs mannitol.图5 SnoN蛋白在不同处理组原代RTECs中的表达

Figure 6.Expression of FN protein in primary cultured RTECs after incubated with different conditions(SABC，×400).NC:negative control;C:control;MO:mannitol;HG:high glucose.图6 不同条件培养原代RTECs中FN蛋白表达

RT－PCR结果显示:高糖培养原代RTECs 30 min即能促进FN mRNA表达，并随高糖培养时间延长，FN mRNA表达持续增多;高渗处理2 h出现FN mRNA表达增多，但从24 h起各时点仍显著少于高糖培养组，见图8。

Figure 7.Expression of FN protein in primary cultured RTECs after incubated with normal－glucose，mannitol and high－glucose medium at different time points.＊＊P ＜ 0.01 vs control;##P ＜0.01 vs mannitol.图7 FN蛋白在不同处理组原代RTECs中的表达

Figure 8.Expression of FN mRNA in primary cultured RTECs after incubated with normal－glucose，mannitol and high－glucose medium at different time points.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs mannitol.图8 FN mRNA在不同处理组原代RTECs中的表达

4 siRNA 转染效率检测

转染绿色荧光标记control siRNA的肾小管上皮细胞内可见绿色荧光表达，并位于细胞核位置，提示siRNA已转染至细胞内，见图9。

RTECs转染 control siRNA和 SnoN siRNA后，control siRNA转染组SnoN蛋白和mRNA与未转染RTECs相比差异无显著;与未转染 RTECs相比，SnoN siRNA转染组SnoN蛋白和mRNA水平分别下降48.63%和54.41%，见图10。

5 转染SnoN siRNA对高糖培养RTECs SnoN蛋白表达的影响

RTECs成功转染SnoN siRNA后给予高糖条件培养，分别于培养30 min、2 h、12 h、24 h 和 48 h 收集细胞蛋白，Western blotting检测各时点SnoN蛋白的表达。结果显示，随高糖培养时间延长SnoN蛋白表达减少，至48 h时几乎检测不到SnoN蛋白表达，见图11。

Figure 9.Fluorescein－conjugated control siRNA was used to transfect the primary cultured RTECs.图9 转染fluorescein conjugated control siRNA的原代RTECs

Figure 10.The protein(A)and mRNA(B)levels of SnoN in RTECs transfected by SnoN siRNA.±s.n=3.＊＊P＜0.01 vs control.图10 肾小管上皮细胞转染SnoN siRNA后SnoN蛋白(A)和mRNA(B)表达水平

Figure 11.Expression of SnoN protein in RTECs transfected by SnoN siRNA as incubated with high glucose.±s.n=3.＊＊P ＜0.01 vs control group.图11 高糖培养转染SnoN siRNA RTECs中SnoN蛋白的表达

6 SnoN siRNA转染对高糖培养RTECs FN蛋白表达的影响

Western blotting结果表明，高糖显著上调RTECs中FN蛋白表达，转染SnoN siRNA后高糖诱导的FN蛋白表达进一步增多，与单纯高糖培养相比增加68.53%，见图12。

讨 论

Figure 12.Expression of FN protein in RTECs transfected by SnoN siRNA as incubated with high glucose.±s.n=3.＊＊P ＜ 0.01 vs control;#P ＜ 0.05 vs high glucose.图12 高糖培养转染SnoN siRNA RTECs中FN蛋白的表达

随着对肾间质纤维化机制研究的加深，RTECs在其中的作用日益被重视。目前已证明，RTECs的转分化、增生及凋亡等均参与了肾间质纤维化过程。因此，研究RTECs形态和功能的异常变化，对阐明肾间质纤维化发病机制有重要作用。当前，国内外对于RTECs的研究大多采用细胞株，但进行生物学研究时，原代培养的RTECs更能反应其在体内的生长特性。本研究参考国内外文献报道[4，5]，并在本课题组前期培养基础上加以改进，原代细胞呈明显的上皮细胞生长特性，E－cadherin和CK－18蛋白表达阳性，且未见 α－SMA蛋白表达，表明大鼠原代RTECs培养成功。

我们用高糖处理原代培养的RTECs，并用相同浓度的甘露醇作为对照，以排除渗透压的影响。动态观察结果发现，SnoN和FN蛋白均有表达于肾小管上皮细胞，与正常糖对照组相比，高糖培养2 h起肾小管上皮细胞中SnoN蛋白表达开始减少，且呈时间依赖性，至96h时只有少量表达。我们的体外研究还发现，高糖在降低SnoN蛋白表达的同时能促进FN蛋白和mRNA表达，且对SnoN蛋白和FN表达的影响显著高于渗透压对照组。以上结果提示，高糖是引起RTECs SnoN蛋白表达减少的主要原因;随着SnoN蛋白表达减少，RTECs中FN蛋白和mRNA表达增加。

有关SnoN的研究，目前多集中于其与肿瘤发生的关系上[6－9]，Yang 等[10]研究报道 SnoN 蛋白表达减少在单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)所致肾纤维化的发生中起重要作用。我们前期的研究结果提示，SnoN蛋白表达减少在糖尿病大鼠肾小管－间质纤维化发病过程中可能起着重要作用[1－3]。但无论是在UUO还是DN肾纤维化发病过程中，SnoN蛋白表达减少是通过那些途径引起肾小管－间质纤维化的，以及其与肾间质纤维化的那些成份有关，目前仍不甚清楚。

本实验中用fluorescein conjugated control siRNA作为对照，通过荧光显微镜观察到绿色荧光主要分布于细胞核及核周区，初步推断SnoN siRNA导入细胞，并进入了细胞核。但进入细胞内的SnoN siRNA是否对SnoN基因有抑制作用，还需对转染细胞进行检测。本研究通过RT－PCR和Western blotting进行检测，显示转染 SnoN siRNA的 RTECs与正常RTECs相比，SnoN mRNA和蛋白的表达分别下降54.41%和48.63%，而转染 control siRNA不影响RTECs SnoN mRNA和蛋白表达，说明本实验siRNA技术对SnoN基因表达抑制的有效性。

用高糖培养转染SnoN siRNA的原代RTECs，结果发现随培养时间延长SnoN蛋白表达减少，至高糖培养48h时几乎检测不到SnoN蛋白表达，进一步证实了高糖能抑制RTECs SnoN蛋白表达。我们前期研究发现，随糖尿病大鼠肾组织中SnoN蛋白表达减少，对致纤维化细胞因子转化生长因子－β1的抑制作用减弱，FN蛋白表达增加，细胞基质沉积增多，肾小管－间质纤维化病变加重[2]。但在DN发生发展中SnoN是否参与了FN表达的调控，以及SnoN表达减少在肾小管－间质纤维化发生发展中的作用是否与FN有关，尚不清楚。本次实验显示，与单纯高糖培养组相比，高糖诱导的肾小管FN的表达在SnoN siRNA转染细胞中显著增多。这些结果说明SnoN表达减少参与了高糖诱导的RTECs中FN合成过程，SnoN表达下调所引起的DN肾小管－间质纤维化与RTECs中FN的表达增多有关。

由于肾小管－间质纤维化的严重性与DN预后密切相关，但DN发病机制至今尚未完全阐明，且缺乏有效的治疗措施。而本研究发现SnoN蛋白表达减少参与了高糖环境下肾小管－间质纤维化主要成份FN的合成过程，将有助于进一步阐明DN的发病机制，并为药物开发提供新的靶点。

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