STAT4基因与吉林人群强直性脊柱炎关联研究

杨 帆 张建佚 周 林 宋玉国 张吉林 朱小泉 张玉荣 黄慈波 霍正浩 杨 泽

强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)属类风湿因子阴性慢性进行性炎性疾病，主要侵犯骶髂关节及中轴骨骼，也可累及髋关节、外周关节及韧带附着点等，可引起椎间盘纤维环及其附近韧带钙化和骨性强直。此病炎症高度活动和低度活动相交替，好发于青少年，发病者多为10～40岁的男性。黄种人中发病率为0.2% ～0.5%，男性患者多于女性患者，男女比例为10∶1［1］。强直性脊柱炎的病因及发病机制尚不清楚，目前普遍认为是遗传因素与环境因素相互作用的结果。

STAT4属转录活化因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)家族，主要被 IL－12激活，在 Th1/Th2的分化调控及因其失调引发的各种炎症性疾病中有重要的作用。STAT4是Th1细胞发育必不可少的，若STAT4缺失可减轻T细胞介导的炎症反应。在实验性变态反应脑脊髓炎、关节炎、大肠炎、心肌炎及非肥胖型糖尿病小鼠模型实验中，与野生型小鼠相比，STAT4缺陷小鼠的炎症反应更轻，且发病率更低［2，3］。

我们希望通过观察STAT4基因上rs7574865、rs8179673、rs10181656和rs7582694在吉林强直性脊柱炎患者及正常对照人群之间的分布频率，以探讨 rs7574865、rs8179673、rs7582694和rs10181656与吉林人群强直性脊柱炎患病风险之间的关联。

1.材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 研究对象 强直性脊柱炎患者来自北华大学附属医院检验中心，其中男性40名，女性16名，共56名，男女性别比约2∶1，年龄范围(14～44)岁，平均年龄24岁;56名对照血液标本来自吉林地区的无血缘关系的健康正常人群，男性43名，女性13名，年龄范围(39～72)岁，平均年龄46岁。所有病例均符合1985年修订的纽约诊断标准［4］。所有研究对象均对该检测项目知情同意，并提供外周血用于实验。

1.1.2 主要试剂 全基因组DNA提取试剂盒购自Bio Chain公司;Taq DNA聚合酶和dNTP购自北京鼎国生物技术有限公司;LC－Green Plus饱和荧光染料购自美国Idaho公司;限制性内切酶购自MBI Fermentas公司。引物由上海生工生物技术开发有限公司合成;基因测序由华大基因测序部完成。

1.1.3 主要仪器 PCR扩增仪为美国MJ公司的PTC－225型PCR仪;高分辨熔解曲线(HRM)基因突变/基因分型检测系统为美国Idaho公司Lightscanner TMHR－I 96;DNA定量分析仪为德国Eppendorf公司的Biophotometer蛋白/核酸比色仪。凝胶成像系统为美国Bio－Rad公司的Gel DOC－2000成像系统。离心机为美国Beckman公司的Allegra TM 21R型离心机。

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA提取及定量 取EDTA抗凝的受试者外周血0.5ml，用全基因组DNA提取试剂盒抽提DNA，通过蛋白/核酸比色仪对提取的基因组DNA进行浓度和纯度的分析。根据测定结果将样本DNA稀释至20μg/μl的工作液置于4℃冰箱。

1.2.2 基因分型方法 采用聚合酶链式反应－高分辨率熔解曲线(PCR－HRM)及聚合酶链式反应－限制性位点多态性(PCR－RFLP)技术，并结合测序验证分型结果。rs7574865、rs8179673和rs7582694位点用PCR－HRM技术进行分型，rs10181656位点用传统的 PCR－RFLP技术进行分型。

1.2.3 引物合成 从Genebank中查得这4个SNPs位点上下游序列，通过Oligo 6.0和Primer5.0软件设计引物。rs7574865引物序列为:F:5'－AATTACATGAGTGTGTATGCAGTAAA －3'，R:5'－CCCTGAAATTCCACTGAAATAAGAT －3';rs8179673引物序列为:F:5'－CTGCCATAGAAGTCTTTGAAGC－3'，R:5'－GATGATGATGTGTATGGTGGTT－3';rs10181656引物序列为:F:5'－ACTGTGATAGATAACTAGCTGGAAT－3'，R:5'－AAAGCAGGGAACGAGGAAGAT－3';rs7582694引物序列为:F:5'－CCTTCCAATGGTTTCTCATTTCAA －3'，R:5'－ AAAGAACAAGCAAACATGCATAG －3';低温内参:F:5'－TTAAATTATAAAATATTTATAATATTAATTATATATATATAAATATAATA － 3'，R:5'－ TATTATATTTATATATATATAATTAATATTATAAATATTTTATAATTTAA－3';高温内参:F:5'－GCGCGGCCGGCACTGACCCGAGACTCTGAGCGGCTGCTGGAGGTGCGGAAGCGGAGGGGCGGG －3'，R:5'－CCCGCCCCTCCGCTTCCGCACCTCCAGCAGCCGCTCAGAGTCTCGGGTCAGTGCCGGCCGCGC－3'。寡核苷酸内参末端用C3封闭，以阻止延伸反应。

1.2.4 PCR反应 PCR反应体系均为10μl。HRM用PCR 体系含:模板 DNA 1μl，10 × PCR Buffer 1μl，dNTP(10mmol/L)0.2μl，Taq DNA 聚合酶(5U/μl)0.2μl，上下游引物各(10pmol/μl)0.1μl，上下游高低温内参各 0.05μl，1 × LC－Green Plus饱和荧光染料 1μl及双蒸水 6.2μl。RFLP 用PCR 体系包含:模板 DNA 1μl，10 × PCR Buffer 1μl，dNTP(10mmol/L)0.2μl，Taq DNA 聚合酶(5U/μl)0.2μl，上下游引物各0.1μl及双蒸水7.4μl。PCR反应条件为:95℃预变性5min后进入主循环，95℃变性30s，退火，72℃延伸(rs7574865退火温度为61℃，退火时间为20s，延伸时间为7s;rs8179673退火温度为 52℃，退火时间为 25s，延伸时间为 12s;rs10181656退火温度为61℃，退火时间为30s，延伸时间为30s;rs7582694退火温度为53℃，退火时间为25s，延伸时间为12s)，总共35个循环，完成后72℃延伸7min。之后用HRM技术分型的样本需进行变性和复性处理，程序为:95℃ 30s，25℃ 2min，94℃ 30s，24℃ 4min。rs7574865 PCR 扩增产物长56bp，rs8179673 PCR扩增产物长104bp，rs10181656 PCR扩增产物长101bp，rs7582694 PCR扩增产物长120bp。

1.2.5 HRM检测 将PCR产物移入HRM专用96孔板内，在Light Scanner TMHR－I 96上进行HRM分析:从45℃开始，以0.3℃/s的斜率采集熔解曲线，到98℃结束，用Light Scanner Call IT软件对采集后的曲线进行分析，判定基因型。

1.2.6 RFLP分型 PCR产物经8%PAGE电泳后，凝胶成像观察PCR扩增结果，符合要求后，用DdeⅠ酶进行酶切，时间控制在7～8小时。酶切完成后8%PAGE电泳，凝胶成像观察分型结果。酶切体系共 10μl，其中包括:Buffer 1μl，DdeⅠ酶0.3μl，双蒸水5.7μl和 PCR 产物3μl。

1.2.7 测序验证 根据HRM分析的不同曲线及酶切结果确定不同的基因型。从所得的不同基因型的个体中分别随机抽取5例样本进行测序验证。测序样本重新进行PCR扩增，测序用PCR引物与PCR反应所用引物相同。PCR反应体系 50μl，包含:DNA 模板 5μl，10 × PCR Buffer 5μl，10 mmol/L dNTP 1μl，Taq DNA 聚合酶(5U/μl)1μl，上下游引物(10pmol/μl)各0.5μl，去离子水补充总体积至50 μl。PCR反应条件与第一次PCR条件相同。PCR产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，经凝胶成像系统观察合格后送华大基因测序部进行测序验证。

1.3 统计学方法 运用Hardy－Weinberg平衡检验研究样本的群体代表性。用比数比(OR)值及其95%可信区间(95%CI)来评价相对风险。组间基因型频率及等位基因频率比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异显著性标准。

2.结果

2.1 STAT4基因分型结果 PCR产物经HRM分析后，可根据样本的熔解曲线差异，将所有样本分为3个组。3组之间的熔解曲线差异非常明显，见图1。测序结果进行网上BLAST比对，序列完全一致。rs10181656PCR产物经DedⅠ酶切后，GG型为两个条带，分别长66bp和35bp;GC型为三个条带，分别长 101bp、66bp和 35bp;CC型为一个条带，长101bp，见图2。HRM及RFLP分型结果与测序的结果完全吻合，准确率为100%，测序图见图2。

2.2 STAT4基因型和等位基因频率在病例组及正常对照中的分布 用SPSS 16.0软件对STAT4基因上4个SNP位点rs7574865、rs8179673、rs10181656及rs7582694在病例和对照中基因型和等位基因频率分布进行分析后，发现无显著性差异(P ＞0.05)，见表1。

2.3 STAT4基因单倍型频率和风险分析 用SHEsis在线软件将这4个SNPs组成的单倍型进行频率和风险分析后，结果只有rs8179673和rs10181656组成的单倍型TG在病例和对照中分布具有显著性差异(P=0.045;OR=3.126，95%CI:0.973～10.044)，见表2。

表1 吉林人群中STAT4基因型和等位基因频率分布比较

表2 STAT4基因单倍型频率和风险分析

续表2

3.讨论

STAT4基因定位于2q32.2－32.3，全长121kb，含24个外显子，编码序列(CDS)区由2247个连续核苷酸组成，编成748个氨基酸。STAT4具有STAT家族其他成员相似的蛋白结构，均由C端的转录激活区，近C端的Src同源结构域及所有STAT共有的701氨基酸上的酪氨酸位点，中部的DNA结合域及N端保守区等几部分构成。但STAT4的表达谱不及其他STAT蛋白广泛，主要分布在淋巴和髓系组织中。STAT4主要由 IL －12 激活，但也可被 IFN － α/β，IL －23 激活［5，6］。IL－12与受体(IL－12R)特异性结合，IL－12R发生二聚化，激活JAK，继而受体信号转导链特定区域酪氨酸位点磷酸化，招募STAT4单体，JAK对STAT4单体产生激活作用。活化后的STAT4形成同源二聚体，并穿越核膜识别DNA上的特定靶序列，启动特异的基因转录，从而增加IFN－γ的产生［7］。

Zervou等发现rs7574865突变等位基因T，一个之前曾报道与许多自身免疫性疾病有关的等位基因，在银屑病患者中要比在对照中更普遍，因此推论rs7574865多态性与希腊银屑病的发生有关［8］。Ji JD等进行的 meta分析说明rs7574865与类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮显著关联［9］。另外许多研究已报道STAT4是与类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮及Ⅰ型糖尿病关联的易感基因［10～13］。

为探讨STAT4这4个SNPs与吉林人群AS发生的关系，我们采用病例 －对照设计，应用 PCR－HRM技术检测rs7574865、rs8179673和 rs7582694，用 PCR －RFLP技术检测了rs10181656多态性在吉林AS病例组与正常对照组之间的分布情况。在本研究中，我们对病例组和正常对照组的基因型频率进行了Hardy－Weinberg平衡检验(P＞0.05)，表明我们所选择的群体具有很好的代表性。我们用基因片段测序技术对PCR－HRM和PCR－RFLP技术进行验证和质量控制，准确率100%，基因分型结果稳定可靠。

本研究结果显示，rs7574865、rs8179673、rs7582694和rs10181656位点的各种基因型频率及各等位基因频率在吉林AS病例组与正常对照组之间的分布均无显著性差异(P＞0.05)。本研究结果表明 rs7574865、rs8179673、rs7582694和rs10181656可能与吉林人群AS的发生无关联。但经多位点单倍型频率分布分析后发现，rs8179673和rs10181656位点组成的单倍型TG在病例和对照中分布具有显著性差异(P=0.045;OR=3.126，95%CI:0.973 －10.044)。因此，我们可以推断在rs8179673和rs10181656之间的连锁区域内或其周围序列中可能存在与AS真正关联的变异。

限于本研究所涉及的样本数量有限，本次研究未发现STAT4基因与吉林人群AS发生之间的关联性，但本研究结果尚不能确定STAT4基因与吉林人群AS发生之间的确切关系。

对于STAT4基因与吉林人群AS发生相关性的最终结论，还需在其他群体及更大样本中进一步探索，以便为AS的病因学研究、诊断及治疗提供理论依据。

附图

图1 HRM分析rs7582694，灰色为GC型，红色为GG型，为CC型

图2 rs10181656 位点 PCR 产物酶切电泳图，1、3、5、7、8、9、10、11为 GC 型(101bp、66bp和35bp)，12为 GG 型(66bp和35bp)，2、4、6为 CC 型(101bp)

1 Laval S H，Timms A，Edwards S，Bradbury L，Brophy S，Milicic A，Rubin L，Siminovitch K A，Week D E，Calin A，Wordsworth B P，Brown M A.Whole-genome screening in ankylosing spondylitis:evidence of non-MHC genetic-susceptibility loci［J］.Am J Hum Genet，2001，68(4):918－926.

2 Finnegan A，Grusby MJ，Kaplan CD，et al.IL －4 and IL －12 regulate proteoglycan-induced arthritis through Stat-dependent mechanisms［J］.J Immunol，2002，169(6):3345 －3352.

3 Yang Z，Chen M，Ellett JD，et al.Autoimmune diabetes is blocked in Stat4-deficient mice［J］.J Autoimmun，2004，22(3):191 －200.

4 Goie The H S，Steven M M，van der Linden S M，Cats A，Evaluation of diagnostic criteria for ankylosing spondylitis:A comparison of the rome，new york and modified new york criteria in patients with a positive clinical history screening test for ankylosing spondylitis［J］.Br J Rheumatol，1985，24(3):242 －249

5 Nguyen KB，Wafford WT，Salomon R，et al.Critical role for STAT4 activation by typeⅠinterferons in the interferon-gamma response to viral infection［J］.Science，2002，297(5589):2063 －2066.

6 Watford WT，Hissong BD，Bream JH，et al.Signaling by IL －12 and IL－ 23 and the immunoregulatory roles of STAT4［J］.Immunol Rev，2004，202(2):139 －156.

7 Wafford WT，Morignehi M，Morinobu A，et al.The biology of IL －12:coordinating innate and adaptive immune responses［J］.Cytokine ＆Growth Factor Rev，2003，14(5):316 －368.

8 Zervou MI，Goulielmos GN，Castro-Giner F et al.STAT4 gene polymorphism is associated with psoriasis in the genetically homogeneous population of Crete，Greece［J］.Hum Immunol.70(9):738 －741.

9 Ji JD，Lee WJ，Kong KA et al.Association of STAT4 polymorphism with rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus:a meta-analysis［J］.Mol Biol Rep.2010，37(1):141 －7.

10 Liang YL，Wu H，Li PQ et al.Signal transducer and activator of transcription 4 gene polymorphisms associated with rheumatoid arthritis in Northwestern Chinese Han population［J］.Life Sci，2011，1，89(5 －6):171－5.

11 SU Yin，ZHAO Yi，LIU Xu 等.Variation in STAT4 is associated with systemic lupus erythematosus in Chinese Northern Han population［J］.中华医学杂志(英文版)，2010，123(22):3173 －3177.

12 李萍，栾海霞，胡朝军等.IRF7/KIAA154和STAT4基因多态性与中国汉族人群系统性红斑狼疮的相关性［J］.中华检验医学杂志，2010，33(7):611 －617.

13 Zervou MI，Mamoulakis D，Panierakis C et al.STAT4:a risk factor for type1 diabetes?［J］Human Immunology，2008，69(10):647 －650.