炮制对葛根中总黄酮及葛根素含量的影响

2011-09-13谢朝晖

中国医药导报 2011年1期

吴可，谢朝晖，王芳

(湖南中医药大学第一附属医院药剂科，湖南长沙 410007)

葛根为豆科植物野葛[Pueraria lobata(wild)Ohwi]的干燥根，性凉、味甘、辛。具有解肌退热、生津透疹、升阳止泻的功效。生葛根擅于解肌退热、透疹生津；麸煨品发散作用缓和，增强止泻的作用[1]。葛根主要含有黄酮类物质20 余种及葛根苷类、三萜类等成分[2]。药理研究表明，葛根总黄酮和葛根素具有使冠状动脉扩张、降低心肌耗氧量、改善微循环、解痉及降压等作用。本实验对葛根采用不同炮制方法下总黄酮和葛根素的含量进行了研究，现报道如下：

1 仪器与试药

1.1 仪器

UV-9200 紫外可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）；DHG101 电热恒温鼓风干燥箱（巩义市英峪予华仪器厂）；SK3300H 超声提取器（上海科学超声仪器公司）；AR1140分析天平（奥豪斯国际贸易公司）。

1.2 试药

葛根饮片购于湖南省邵阳市廉桥药材市场，经鉴定为野葛[Pueraria lobata（wild）Ohwi]的干燥根。葛根素（批号：0752-9605，湖南省药品检定所），硅胶gF254（批号：050630，青岛海洋化工厂），其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 样品制备

2.1.1 生葛根取葛根片，净制，粉碎，过二号筛，为1 号粉。

2.1.2 麦麸煨制[3]按文献将葛根片煨至呈焦黄色时取出，筛去麦麸（麦麸用量为每100 克葛根用麦麸30g），放凉，粉碎，过二号筛，为2 号粉。

2.1.3 麦麸烘制[4]取100g 葛根片置方盘中，上下各铺一层麦麸，烘制条件为：165℃、40 min 取出放凉（麦麸用量为每100 克葛根用麦麸30g），粉碎，过二号筛，为3 号粉。

2.2 含水量测定[5]

分别称取1、2、3 号粉约1g，精密称定，平铺于干燥至恒重的称量瓶中，开盖，置干燥箱中，在105℃ 干燥5 h，将瓶盖好，转移至干燥器中冷却30 min，精密称定重量，再于105℃干燥1 h，冷却，称重，至连续两次称重差异不超过5 mg为止，根据减少的重量计算供试品含水量，结果见表1。

表1 生品与制品含水量测定结果Tab.1 determination result of moisture in Pueraria lobata Ohwi and preparation Pueraria lobata Ohwi

2.3 醇溶性浸出物的测定[5]

分别取供试品约2g，精密称定，置250 ml 的锥形瓶中，精密加95%乙醇50 ml，密塞，称定重量，静置1h 后，连接回流，加热至沸腾，并保持微沸1 h，放冷后，精密称定重量，用水补足减失重量，摇匀，用干燥滤器滤过，精密量取滤液25 ml，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，于105℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定。结果见表2。

表2 醇溶性浸出物含量测定结果Tab.2 Contentdetermination results of ethanol-soluble extractives

2.4 总黄酮含量的测定[6-7]

2.4.1 线性关系考察取干燥至恒重的葛根素标准品约5 mg，精密称定，置25 ml 量瓶中，用95%乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，精密吸取 0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 ml分别置 10 ml 量瓶中，用95%乙醇定容至刻度，摇匀，在251 nm 处测定吸光度，以浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：A=0.062 4C+0.001 0（r=0.997 9），结果表明，葛根素在4.008～12.024 μg/ml 范围内呈良好的线性关系。

2.4.2 精密度取“2.4.1”项下已配得葛根素浓度为8.016 μg/ml的溶液，共5份，按“2.4.1”项下方法测定吸光度，计算RSD为0.36%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 重复性试验分别称取1、2、3 号粉，共 6份，按“2.4.6”项下方法操作，在相同条件下测定，计算得总黄酮含量量分别为 0.676、0.810、0.874g，符合要求。

2.4.4 稳定性试验取1、2、3 号粉适量，按“2.4.6”项下方法操作，分别在 0、2、4、8、12、24h 进行测定，计算得总黄酮含量分别为3.09%、3.55%、3.79%。结果表明，溶液在24h 内基本稳定。

2.4.5 加样回收率试验精密量取已知含量的样品液5份，分别置5个10 ml 量瓶中，分别加入5 ml 已测定浓度为4.008 μg/ml的样品液，用95%乙醇定容至刻度，摇匀，在251 nm 处测定吸光度，计算回收率，加样回收率计算公式：回收率=（加入纯品后的测得总量-样品中所含被测成分量）/加入纯品量，结果见表3。

表3 总黄酮加样回收率试验（n=5）Tab.3 Results of recovery test of total flavonoids(n=5)

2.4.6 样品含量测定分别称取1、2、3 号粉约25g，精密称定，放入500 ml 圆底烧瓶中，加80%乙醇150 ml 溶解，先超声20 min，再热回流提取30 min，提取3次[8]，抽滤洗涤，合并3次滤液，摇匀，转移至蒸发皿中浓缩至干，放入烘箱中干燥至恒重，分别取3 种提取物约30 mg，精密称定，分别置50 ml量瓶中，用95%乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，再分别取1 ml置3个50 ml 量瓶中，用95%乙醇溶解并定容至刻度，以空白溶剂作对照，在251 nm 波长处测定吸光度，根据标准曲线方程计算总黄酮的含量，结果见表4。

表4 各供试品总黄酮含量测定结果（n=3）Tab.4 Contentdetermination results of total flavonoids indifferent sample（n=3）

2.5 葛根素的含量测定[8]

2.5.1 线性关系考察取葛根素对照品约1.5 mg，精密称定，置25 ml 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取标准溶液 0.9、1.0、1.1、1.2、1.3 ml分别置 10 ml 量瓶中，各加甲醇至刻度，摇匀，以甲醇为空白对照液，在251 nm 波长处测定吸收度，以浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：A=0.080 5C+0.048 3（r=0.997 6），结果表明葛根素在1.248～6.240 μg/ml 范围内具有良好的线性关系。

2.5.2 重复性试验分别称取1、2、3 号粉，共6份，按供试品溶液制备方法操作，在相同条件下测定，计算得葛根素平均质量分别为 0.398、0.555、0.606g，符合要求。

2.5.3 稳定性试验取 1、2、3 号供试品溶液分别在 0、2、4、8、12、24h 进样，在上述条件下进行测定，计算得葛根素含量分别为1.82%、2.43%、2.64%。结果表明，溶液在24h 内基本稳定。

2.5.4 加样回收率试验按 “2.5.5”项下方法操作，取浓度为4.008μg/ml 对照品溶液，共5份，分别加入已知浓度为5.407μg/ml、体积为9 ml 的样品溶液中，以95%乙醇为空白溶液，在251 nm 波长处测定吸收度，根据回归方程计算回收率。得平均回收率为98.06%，RSD=0.31%（n=5）。结果见表5。

表5 葛根素加样回收率试验（n=5）Tab.5 Results of recovery test of puerarin(n=5)

2.5.5 样品含量测定

2.5.5.1 薄层层析板制备[8]取硅胶H 加0.5%CMC-Na 溶液，混匀，湿法制板，凉干后，105℃活化0.5 h，备用。

2.5.5.2 供试品溶液制备分别取1、2、3 号粉提取物约30 mg，精密称定，分别置3个50 ml 量瓶中，超声20 min，使提取物充分溶解，分别取1 ml 置3个50 ml 量瓶中，分别定为1、2、3 号供试品溶液，备用。

2.5.5.3 葛根素含量测定[9]用进样器精密取葛根素标准液及1、2、3 号供试液各10 μl 点样于制备好的薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（7∶2.5∶0.25）配制展开剂，将展开剂倒入展开槽中，再把点好供试液的薄层板放入展开槽中，先不接触展开剂，使薄层板饱和15 min 后，再放入展开剂中进行展开，展开约10 cm 后取出，喷适量氨水于薄层板，在紫外灯下365 nm处，根据荧光画定斑点位置，刮下斑点于具塞试管中，加5 ml甲醇，超声20 min，再离心10 min，倒出溶液，以甲醇为空白对照液，在251 nm 波长处测定吸收度，代入回归方程，计算样品中葛根素含量，结果见表6。