瞬时受体电位蛋白通道A1在大鼠炎症性膀胱感觉通路中不同部位的表达变化

都书琪，吴伟力，张骞，孔垂泽

（中国医科大学附属第一医院泌尿外科，沈阳 110001）

膀胱中尿液的逐渐蓄积是一种伸展性质的刺激，它会被转化为传入神经的电活动，最终触发排尿反射［1］。在有下尿路症状的疾病中，例如膀胱炎症、膀胱过度活动症等，储尿期症状是困扰患者的主要问题，例如尿频、尿急、急迫性尿失禁等。其中一个可能的发病机制是膀胱传入神经通路活动的增强，所以膀胱的感觉传导机制是一个重要问题。膀胱黏膜中存在机械敏感性分子，受到伸展刺激后，会引起腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine-triphosphate，ATP）等释放，ATP会进一步激活黏膜下层感觉神经末梢上的P2X受体，从而将膀胱容量改变的信号传递到排尿中枢［2，3］。另外，膀胱感觉神经末梢本身也有机械敏感性受体的表达，可能在生理或者病理状态下参与膀胱感觉传导。

瞬时受体电位蛋白通道A1（transient receptor potential channel A1，TRPA1）是哺乳动物体内机械敏感性分子的候选者，它还参与疼痛的感觉传导，并且与炎性反应相关［4～6］。在前期研究中，我们发现膀胱黏膜上皮细胞和脊髓后根神经节中支配膀胱的初级感觉神经元都表达TRPA1［7］，人的梗阻性膀胱上皮中TRPA1的表达升高［8］，所以TRPA1可能在黏膜层和感觉神经元两个部位参与膀胱的感觉传导。膀胱内灌注TRPA1的受体激动剂引起排尿反射亢进［7］，提示它可能在病理状态下的排尿改变中发挥作用。我们制作了大鼠的膀胱炎症模型，并检测膀胱黏膜层以及脊髓后根神经节两个部位TRPA1的表达水平是否有改变，以求阐明哪一个部位的TRPA1与膀胱炎症以及炎症状态下的排尿改变之间存在可能的联系。

1 材料与方法

1.1 实验材料

18周龄的雌性SD大鼠购自中国医科大学动物部，体质量210 g。环磷酰胺及乌拉坦购自Sigma公司。RNA提取试剂盒 RNEASY Mini Kit、DNase I、RNAlater购自Qiagen公司。逆转录及定量PCR采用的PrimeScript RT reagent Kit试剂盒购自TaKaRa公司。

1.2 动物处理

实验组采用5只大鼠，腹腔内注射环磷酰胺（300 mg/kg，溶于1 mL生理盐水中）。注射48 h后乌拉坦腹腔内注射麻醉大鼠，先迅速摘除膀胱，将其剖开后，取一小块全层组织置于OCT胶中包埋，以备HE染色用，将其余膀胱组织立即浸泡于RNAlater中；缝合腹部切口后自后背腰骶部纵行切开，去除脊柱棘突及椎板，于实体显微镜下，采用显微外科器械，摘除L6S1节段的脊髓后根神经节，固定于RNAlater中；处死大鼠后，于实体显微镜下，将已经浸泡于RNAlater中的膀胱黏膜层从肌层上分离下来，分离过程中尽量减少肌层混入黏膜层中。对照组5只大鼠腹腔内注射1 mL生理盐水，其余操作与实验组动物相同。浸泡于RNAlater中的标本4℃过夜后-20℃保存。

1.3 提取mRNA及逆转录

膀胱黏膜层和脊髓后根神经节中的mRNA采用试剂盒推荐的操作步骤提取。RNA中残留的基因组DNA采用DNase I消化，以避免在后面的PCR反应中基因组DNA的扩增干扰结果。测定RNA浓度后，2～8 μL RNA加入20 μL的反应体系中进行逆转录，采用随机六聚体引物，反应条件：42℃20 min。

1.4 定量PCR

2 μL cDNA加入25 μL的定量PCR反应体系中。TRPA1的引物序列F：5′-CTCAGGTTCAATGTG TCCGTTC-3′；R：5′-GTGCTGTGTTCCCTTCTTCATC-3′［7］。我们选用 β-actin 作为内部对照，其引物序列F：5′-TGTGTTGTCCCTGTATGCCT-3′；R：5′-TAATGTC ACGCACGATTTCC-3′［7］。TRPA1 的反应条件：95 ℃15 s，1个循环；95℃ 5 s变性，65℃ 20 s退火及延伸，82.5℃7 s检测荧光信号，共40个循环；溶解曲线分析。β-actin的反应条件是：95℃15 s，1个循环；95℃5 s变性，55℃20 s退火，72℃20 s延伸及检测，共40个循环；溶解曲线分析。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 膀胱炎症

腹腔内注射环磷酰胺48 h后摘除膀胱时，肉眼可以见到膀胱充血、水肿，HE染色证实膀胱的炎性改变。

2.2 显微操作及PCR的定性分析

摘除大鼠的L6S1脊髓后根神经节，并把膀胱黏膜层从肌层上分离出来。膀胱黏膜层及脊髓后根神经节都表达TRPA1（图1）。定量PCR反应中的溶解曲线分析提示，在所有的反应体系中，均没有非特异性条带出现。反应产物电泳于358 bp见到TRPA1目的条带，也未见到非特异性产物（图1）。

2.3 定量分析

TRPA1的表达量采用管家基因β-actin作为内参标化（TRPA1/β-actin）。在黏膜层，对照组和炎症组的表达水平分别是0.032 9±0.016 2及0.125±0.096 5，两者之间差异没有统计学意义（图2）。在脊髓后根神经节，TRPA1的表达水平明显高于黏膜层。对照组和炎症组的表达水平分别是0.915±0.289及 1.905±0.777（P<0.05）（图 3）。

3 讨论

TRPA1是哺乳动物体内机械敏感性受体的候选者，我们的前期工作发现膀胱黏膜上皮细胞表达TRPA1［7，8］，TRPA1 的通道性质类似于机械感受器中的通道性质［4］。近年来研究者发现膀胱黏膜不单纯的是尿液和血液之间的一个屏障，它还能感知尿液蓄积的伸展刺激，并释放多种生物活性物质，例如ATP［2，3］，进而兴奋黏膜下层的感觉神经末梢。我们设想膀胱黏膜上皮细胞表达的TRPA1起到机械感受器的作用，将伸展刺激与传入神经冲动联系起来［8］。

环磷酰胺被注射到腹腔后，其代谢产物通过肾脏排泄，刺激膀胱，产生炎性反应。这是一个排尿研究领域常用的炎性模型。我们在注射环磷酰胺48 h后观察到膀胱明显充血水肿，HE染色证实膀胱存在炎性反应。炎症状态下，大鼠膀胱的储尿期表现出排尿间隔缩短，排尿次数增加等反射亢进的症状。我们设想炎症可能诱导TRPA1在黏膜上皮细胞的表达，从而间接增强膀胱传入神经通路的兴奋性。本实验中炎性组黏膜层表达TRPA1较对照组略高，但没有统计学意义，提示黏膜上皮细胞中的TRPA1可能不是作为机械敏感性分子发挥作用的，或者说在环磷酰胺诱发炎症的情况下，黏膜层的TRPA1与排尿方式的改变没有确切关系。

我们前期发现支配膀胱的初级感觉神经元中有半数表达 TRPA1［7］，提示在黏膜层外，TRPA1 可能在神经末梢发挥重要作用。在本实验中，我们利用显微外科技术成功摘除脊髓后根神经节，其中TRPA1的表达量是黏膜层的27倍，说明感觉神经中的TRPA1要比黏膜层中的TRPA1发挥更多或更重要的作用。

除了是机械敏感性受体的候选者之外，TRPA1还参与痛觉传导，并且参与炎性反应，此外，也有部分研究支持它是寒冷刺激的受体［6］。在炎性条件下，脊髓后根神经节中TRPA1的表达水平比对照组升高，并且有统计学意义。TRPA1的表达上调能使膀胱传入神经兴奋性增强，排尿反射亢进，从而发生尿频、尿急等。另外，TRPA1还可能通过调节神经末梢释放炎性介质，参与膀胱内的炎性反应［6］。

我们的结果提示在大鼠膀胱中，黏膜上皮细胞表达的TRPA1可能不参与炎性条件下的排尿改变，其作为机械敏感性受体发挥作用的可能性较小。脊髓后根神经节中TRPA1的表达量比黏膜层明显升高，并在炎性条件下，其表达量较对照组增加，它可能参与炎症反应，兴奋膀胱传入通路，改变排尿方式。初级感觉神经元的TRPA1可能参与病理条件下膀胱反射的调节，它可能是病理性排尿方式的治疗靶点。

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