肾透明细胞癌组织中组蛋白乙酰化酶hMOF的表达及其乙酰化位点的初步研究

芦志华，王勇，迟长亮，3，唐宇哲，3，蔡勇，金景姬，王春喜

（1.吉林大学第一医院泌尿外科，长春 13002；2.吉林省人民医院泌尿外科，长春 130021；3.吉林大学研究生院，长春 130012；4.吉林大学生命科学学院，长春 130012）

组蛋白乙酰化修饰在基因转录调控、DNA损伤修复及细胞周期调控等生物学过程中发挥重要作用。组蛋白乙酰化状态的异常与多种疾病有关［1］。组蛋白乙酰化修饰通常发生在H3、H4亚单位上，其中60%的H4呈单乙酰化状态，且多数发生在H4组蛋白N端第16位赖氨酸（K16），即H4K16Ac。目前已知hMOF基因调控H4K16的乙酰化，其缺失将可能导致整个基因组范围内的H4K16Ac减少。另有研究表明，在人体内hMOF的乙酰化位点可能并不仅仅局限于H4K16［2］。目前尚无hMOF基因在肾透明细胞癌（以下简称肾癌）组织中的表达情况及乙酰化位点的报道。本研究拟探讨肾组织中hMOF基因及蛋白的表达情况，及H4K5、K8、K16位点乙酰化水平与hMOF基因表达水平之间的关系，从而进一步明确肾癌的发病机制。

1 材料与方法

1.1 材料

选取我院2008-2010年肾透明细胞癌组织病理切片66例，并以癌旁正常肾组织为对照。汇总患者相关临床资料（年龄、性别、肿瘤最大径、Fuhrman分级、pT分期、局部复发、淋巴结及远处器官转移等）。所有患者均为原发性肾癌，术前均未行放、化疗及靶向药物治疗。收集近期我院行肾癌根治术的肾癌组织样本9例，其中Fuhrman分级Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级各3例，并留取癌旁正常肾组织作为对照。收集样本后立即以液氮冻存。采用Biozol RNA试剂盒（Biomiga公司）1批次提取组织总RNA，用superRT cDNA试剂盒（CWbio公司）将其逆转录成cDNA，-20℃保存。

ABI PRISM 7300荧光实时定量 PCR（qRTPCR）仪 （Applied Biosystems，美国），SYBR Green Mix（ABgene，英国）。hMOF蛋白一抗（Bethyl公司，产品编号：IHC-00497），H4K5、H4K8、H4K16 乙酰化的一抗（Upstate公司，产品编号依次为07-327/07-328/07-329），一抗稀释比例均为1︰250。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR：提取9例肾癌（Fuhrman分级Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各3例）及癌旁正常肾组织共18例标本的总RNA进行qRT-PCR分析。以GAPDH为内参来对hMOFmRNA的表达水平进行标准化。设计hMOF基因荧光 Real-time PCR 上游引物：5′-GAAGTCACGGTGGAGATCGGA-3′，下游引物：5′-CTTGGCCAGCAGACACAGGTT-3′，由上海生工生物技术公司负责合成，产物长度为170 bp。以人GAPDH基因为内参，上游引物：5′-ATGGGTCAGAAGGATTCC TATGT-3′，下游引物：5′-AGCCACACGCAGCTCATT-3′，产物长度400 bp。每例肾癌及癌旁正常肾组织的总RNA样本取3份，人GAPDH基因内参2份，空白对照2份。共58份。qRT-PCR体系如下：SYBR Green 12.5 μL、dH2O 4.5 μL、上、下游引物各 2 μL（浓度 2 mmol/L）、cDNA 模板 4 μL（浓度 2 ng/μL）。40个循环。实验数据的标准化采用ΔΔCt法。

1.2.2 免疫组化：采用标准的免疫组化流程进行操作。组织抗原修复方式：放入枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0）内，高压煮沸1 min。染色结果的评判：hMOF蛋白、H4K5、K8、K16Ac均定位于细胞核内。采用2级计分法：阳性细胞数＜5%，5%～24%，25%～50%，51%～74%及≥75%，分别判定为 0、1、2、3、4 分；每张切片阳性细胞的着色强度按无着色、淡黄色、棕黄色和棕褐色分别判定为0、1、2、3分；根据2项积分之和判定结果：0分为阴性（-），1～3分为弱阳性（+），4～5分为中等阳性（++），6～7分为强阳性（+++）。每例均设有HE切片作对照观察，并设阳性和阴性对照。计分过程由2位病理医师分别完成。

1.3 统计学分析

采用SPSS 13.0统计学软件完成多组资料的单向方差分析以及Fisher检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肾癌组织中hMOFmRNA表达水平的研究

qRT-PCR结果（图1）显示：9例肾癌组织中，4例（44.4%）hMOFmRNA表达水平较其癌旁正常肾组织下降2倍以上（即log2＜-1），其中FuhrmanⅡ级1例，FuhrmanⅢ级3例。

2.2 肾癌组织中hMOF蛋白的表达水平

免疫组化染色结果（图2）显示：66例肾癌组织切片中，26例（39.4%）hMOF蛋白的综合免疫组化评分≤3分（即阴性和弱阳性），其中FuhrmanⅠ级2例（7.7%，2/26），Ⅱ级 6例（23.1%，6/26），Ⅲ级 18例（69.2%，18/26）。

2.3 肾癌组织中H4K5、H4K8、H4K16的乙酰化水平

免疫组化染色结果（图3）显示：在上述26例hMOF蛋白表达下降的肾癌组织切片中，20例H4K5、H4K8乙酰化综合免疫组化评分≤3分（76.9%），其中 FuhrmanⅡ级 4例（20.0%，4/20），Ⅲ级16例（80.0%，16/20）。23例（88.5%）H4K16乙酰化免疫组化评分≤3分，其中FuhrmanⅡ级5例（21.7%，5/23），Ⅲ级 18 例（78.3%，18/23）。H4K5、H4K8、H4K16乙酰化水平与hMOF蛋白的表达水平具有相同的变化趋势：hMOF蛋白表达水平降低，H4K5、H4K8、H4K16乙酰化水平亦降低。

2.4 hMOF蛋白表达水平与肾癌患者临床特点的关系

根据肾癌组织中hMOF蛋白表达水平的综合免疫组化评分，将患者分为hMOF综合免疫组化评分≤3分和＞3分2组。比较2组间临床资料的特点，结果如表1所示：hMOF综合免疫组化评分≤3分组中平均肿瘤直径、FuhrmanⅢ级的病例数、≥pT3期的病例数以及肾门淋巴结转移及远处脏器转移的病例数均显著高于＞3分组，差异有统计学意义（P 值分别为 0.006，0.001，0.039，0.001）。

表1 h M O F蛋白表达水平与肾癌患者临床特点的关系T a b.1 T h e r e l a t i o n o f h M O F p r o t e i n e x p r e s s i o n l e v e l a n d t h e c l i n i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f c c R C C p a t i e n t s C l i n i c a l d a t a h M O F I H C s c o r e s≤3（n=2 6） I H C s c o r e s＞3（n=4 0） P v a l u e M e a n a g e（y e a r） 5 8 6 0 0.7 8 3 M a l e∶f e m a l e 1.4 1.2 0.5 4 5 A v e r a g e d i a m e t e r o f t u m o r（c m） 5.7 3.4 0.0 0 6 F u h r m a nⅢ（%） 6 9.2 1 0.0 0.0 0 1≥p T 3（%） 3 0.7 2 2.5 0.0 3 9 L o c a l l y m p h n o d e o r d i s t a n t m e t a s t a s i s（%） 1 5.4 5.0 0.0 0 1

3 讨论

组蛋白乙酰化是组蛋白修饰的重要内容之一，是基因转录调控的重要调控机制［3］。MOF又称MYST1，是组蛋白乙酰化家族MYST成员之一，具有组蛋白乙酰化酶活性。MOF最基本的功能是乙酰化组蛋白H4第16位赖氨酸，进而产生一系列的生物学作用。研究表明，在人体内，hMOF作用底物不仅仅局限于H4K16［4］。因此，明确hMOF在人体内的功能具有重要意义。目前的研究发现，在前列腺癌及乳腺癌组织中的组蛋白H4呈低乙酰化状态［5］，最近Pfister等研究发现：在乳腺癌和成神经管细胞瘤组织中，hMOF在mRNA水平及蛋白表达水平上均较正常组织显著地降低，并且hMOF的蛋白表达水平与组蛋白H4K16乙酰化水平呈正相关，而临床随访中发现，hMOF蛋白表达量与患者术后生存率相关［6］。本研究通过对肾癌组织及正常肾组织的对照研究，明确了肾透明细胞癌组织中hMOF基因在mRNA水平和蛋白质水平均降低，尤其是在FuhrmanⅢ级的癌组织中更为显著。这说明hMOF缺失将会导致细胞内基因组不稳定，自发的染色体畸变，核形态异常改变，细胞周期功能缺陷等异常［7，8］。通过对肾癌患者临床数据的整理我们发现，hMOF蛋白表达显著下降的患者肾癌的恶性程度、疾病的进展程度以及发生远处转移的风险均显著升高。

最近的研究发现：在人体内hMOF作为催化亚基能够在人体内形成2种乙酰化酶复合物，这使hMOF在人体内具有更多的乙酰化位点，除了已知的乙酰化位点H4K16以外，hMOF在人体内可能还与H4K5和H4K8的乙酰化有关［9］。本研究发现，在肾癌组织中随着hMOF蛋白表达水平的降低，不仅H4K16乙酰化水平显著降低，H4K5、H4K8乙酰化水平也显著降低，这3者的乙酰化水平与hMOF蛋白的表达水平呈正相关。因此，我们初步断定在人体内hMOF蛋白形成的乙酰化酶复合物作用底物不仅仅是 H4K16，还包括H4K5、H4K8，这意味着hMOF基因在人体内具有更复杂的功能，参与到更多的生物学事件中。因此，我们有必要对人体内hMOF酶复合物的构成和功能进行深入研究，阐明hMOF的乙酰基化修饰在人体细胞内的生物学作用。

从肾癌患者的临床病例特点来看，hMOF蛋白表达显著下降的患者其Fuhrman分级越高，意味着肾癌的恶性程度越高，生长速度越快，进而肿瘤直径更大，T分期相对更晚，发生肾门淋巴结转移、远处脏器转移的风险也越高。因此，我们考虑将hMOF蛋白表达水平作为判断肾癌患者病情严重程度的分子标志物，这对于指定患者的治疗方案及随访方案有积极的意义。

综上所述，本研究结果显示：肾透明细胞癌，尤其FuhrmanⅢ级的肾透明细胞癌组织中hMOF基因及蛋白表达水平显著下降。hMOF的乙酰化位点包括H4K16、H4K5、H4K8，且这3者的乙酰化水平与hMOF的表达水平呈正比。hMOF蛋白表达水平与肾癌的恶性程度、临床分期、远处转移的风险有关。

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