吡柔比星联合干扰素抑制大鼠膀胱癌生长的机制

姜华茂，傅德望，司淑斌，宋斌，张春阳

（辽宁医学院附属第一医院泌尿外科，辽宁 锦州 121001）

膀胱癌行经尿道膀胱肿瘤切除术后仍有较高的复发率和进展率［1］。单纯经尿道膀胱肿瘤切除术不能解决术后高复发和进展问题，膀胱灌注是膀胱癌术后治疗的重要方面［2］。多药耐药发生是膀胱腔内化疗失败的重要原因，而联合其他药物是减少多药耐药、增强膀胱灌注疗效的重要方法。吡柔比星和干扰素α-2b膀胱灌注对经尿道膀胱肿瘤切除术后都有一定疗效［3～5］。本研究通过动物实验观察吡柔比星联合干扰素α-2b膀胱灌注对大鼠膀胱癌的作用，并初步探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物和分组：雌性Wistar大鼠80只，10～12 周龄，体质量（200±20）g，购自辽宁医学院实验动物中心。大鼠随机分为对照组、吡柔比星组、干扰素组和联合用药组，每组20只。

1.1.2 主要试剂与设备：N-甲基-N-亚硝基脲（N-methyl-N-nitrosourea，MNU，Sigma公司），以 pH6.0的枸橼酸缓冲液配成浓度为20 mg/mL的溶液；盐酸吡柔比星（深圳万乐药业有限公司），以注射用水配制成1.0 mg/mL吡柔比星溶液；注射用重组干扰素α-2b（安徽安科生物工程集团股份有限公司），以注射用水配制成浓度为30万IU/mL溶液；联合用药组中吡柔比星和重组干扰素α-2b浓度与各单一用药组一致。兔抗大鼠CD34抗体（武汉博士德生物公司）；SABC免疫组化染色试剂盒（武汉博士德生物公司）；DAB显色试剂盒（武汉博士德生物公司）；CD34兔抗大鼠单克隆抗体试剂盒（Santa Cruz公司）；Annexin V细胞凋亡检测试剂盒（北京宝赛生物技术有限公司）。BD FACSCalibur流式细胞仪（Becton Dickinson公司）；Autostainer plus全自动免疫组化染色仪（丹麦DAKO公司）；CIAS-1000型细胞图像分析系统（北京大恒图像视觉有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 膀胱癌模型制作和用药：MNU溶液0.2 mL每周1次膀胱灌注，诱导大鼠膀胱癌。对照组、吡柔比星组、干扰素组和联合用药组大鼠于首次灌注MNU后第8周，分别行生理盐水0.5 mL、吡柔比星溶液0.5 mL、重组干扰素α-2b溶液0.5 mL和吡柔比星+重组干扰素α-2b溶液0.5 mL膀胱灌注，每周1次，共6次。

1.2.2 病理观察：灌注MNU后第8周，每组随机抽取2只大鼠，处死后解剖膀胱，观察膀胱内情况后常规制作光镜切片，HE染色，病理观察。第14周处死其余大鼠，切取膀胱，称膀胱质量。选取一块最大膀胱肿瘤制作石蜡标本块，切片，HE染色，进行病理观察。

1.2.3 免疫组化检测：石蜡标本块切片，厚4 μm，免疫组织化学方法以CD34标记微血管。在不知实验和病理特征的单盲情况下，由专业病理人员先在40倍和100倍镜下扫视整个切片，寻找新生血管热点区，400倍镜下计数染成棕黄色的血管数目，以5个视野下血管数目的平均值表示微血管密度（microvessel densitiy，MVD）。被CD34染成棕黄色的血管内皮，若与邻近微血管、肿瘤细胞或其他结缔组织分开即视为一个微血管，只要结构不相连其分支结构也作为一个血管。

1.2.4 流式细胞仪检测：切取各组病理取材后的肿瘤组织，PBS漂洗，用眼科剪反复剪碎组织，200目不锈钢筛研磨过滤，并不断以PBS冲洗，吸取滤过的单细胞悬液置离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，调整细胞浓度为1×106/mL，以Annexin V细胞凋亡检测试剂盒检测凋亡指数（apoptotic index，AI）。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠存活情况和一般状态观察

大鼠在膀胱灌注后2.0～2.5 h排尿，3.0～4.0 h后恢复活动，诱癌期间各组大鼠毛色、食量、营养状况及体质量等一般情况无明显差别。实验过程中共有63只大鼠存活，其中对照组17只、吡柔比星组16只、干扰素组14只、联合用药组16只。

2.2 病理学观察

第8周时，可见膀胱内微小结节和突起；光镜下移行上皮细胞层数增多，排列紊乱，核染色质为颗粒状，分布不均匀，可见核分裂像，为不典型增生和移行细胞Ⅰ级（图1A）。第14周时，各组大鼠膀胱均可见菜花状、多发、大小不一的肿物；光镜下膀胱黏膜细胞大小不一，细胞层数明显增多，排列非常紊乱，极向消失，核大不规则，核膜增厚，核仁肥大，核质比例增大，核分裂像明显，可见不同级别的肿瘤组织，并侵入肌层（图1B）。

2.3 各组大鼠膀胱的质量

吡柔比星组和联合用药组大鼠膀胱质量小于对照组（P<0.01），联合用药组大鼠膀胱质量小于吡柔比星组（P<0.05），干扰素组大鼠膀胱质量与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

2.4 各组的MVD

3个实验组大鼠膀胱肿瘤的MVD均小于对照组（P<0.01）。联合用药组MVD小于干扰素组（P<0.01），而与吡柔比星组比较差异无统计学意义（P> 0.05），见图2、表1。

表1 各组大鼠膀胱的质量、M VD和AI（±s）Tab.1 The w ei ght s ofbl adders，M VD and AIofal lrat s（±s）Group n Weight of bladder（mg） MVD AI（%）Control 15 294.0±9.9 28.5±5.6 6.56±2.35 Pirarubicin 14 274.4±13.22） 9.8±3.12） 13.16±5.772）Interferon 12 295.3±8.2 21.1± 4.42） 11.5±4.01）Combination 14 265.7±11.72），3），5） 8.5±2.12），5） 22.7±8.22），4），5）1）P ＜ 0.05，2）P ＜ 0.01 vs control group；3）P ＜ 0.05，4）P ＜ 0.01 vs pirarubicin group；5）P ＜ 0.05 vs interferon group.

2.5 各组的AI

联合用药组大鼠的AI值高于其他3组（P<0.01），吡柔比星组和干扰素组的AI大于对照组（P分别<0.01和 0.05），见表1。

3 讨论

用MNU诱癌法建立膀胱原位癌模型具有诱癌周期相对短、膀胱选择性强、诱癌率高等优点，MNU诱发的膀胱肿瘤与人类膀胱癌的组织学和生物学行为类似，适用于对药物治疗效果的评价［6］。本实验中各组大鼠均诱癌成功，死亡17只（17/80），在第1次诱导后第8周大鼠膀胱黏膜出现早期肿瘤表现，而在第14周膀胱肿瘤已呈多方和肌层浸润性改变。由于肿瘤的生长，大鼠膀胱质量增加，其中对照组膀胱质量较大，而吡柔比星组和联合用药组膀胱质量较小（P<0.01），表明膀胱肿瘤的生长受到抑制。干扰素组的MVD低于对照组且AI高于对照组，表明干扰素可抑制肿瘤生长和促进凋亡，但干扰素组膀胱质量与对照组相近（295.3和294.0 mg），可能与干扰素膀胱灌注导致膀胱炎性改变有关。

吡柔比星是一种半合成的蒽环类抗癌药，它能迅速进入肿瘤细胞内，在S期通过直接嵌入DNA核酸碱基对间，干扰转录过程，终止细胞周期，使肿瘤细胞凋亡，故具有较强的抗癌活性。有研究表明，吡柔比星膀胱内灌注后膀胱癌组织有较高浓度聚集，而正常膀胱组织黏膜层只有少量吡柔比星，并且膀胱肿瘤细胞的AI显著高于对照组［7］。本研究也证实了吡柔比星促进膀胱癌细胞凋亡的作用，并且吡柔比星膀胱灌注后膀胱肿瘤的MVD也明显降低，这表明吡柔比星膀胱灌注抑制膀胱肿瘤生长的机制可能与抑制肿瘤血管生成有关。

重组干扰素α-2b具有广谱抗病毒、抗肿瘤、抑制细胞增殖以及提高免疫功能等作用。单独应用干扰素α-2b治疗膀胱肿瘤效果不佳，但与卡介苗等联合应用可取得较好的疗效［3，4］。干扰素α-2b治疗膀胱肿瘤与其增强肿瘤细胞人类主要组织相容性复合体的表达、使肿瘤抗原能呈递给T细胞并激活T细胞有关。干扰素α-2b可以降低肿瘤的碱性成纤维细胞生长因子表达，减少肿瘤的新生血管形成［8］。干扰素α-2b可使Fas配体表达增加，通过Fas/FasL途径诱导肿瘤细胞凋亡［9］。本研究中，干扰素组大鼠膀胱肿瘤的MVD和AI均小于对照组，表明干扰素α-2b可抑制肿瘤微血管生长和促进肿瘤细胞凋亡。

吡柔比星和干扰素分别从不同的机制干预大鼠膀胱肿瘤的生长，联合应用吡柔比星和干扰素后膀胱肿瘤生长明显受到抑制，膀胱质量显著降低，并且MVD较单用干扰素组明显降低，AI也显著高于单一用药组，这可能与吡柔比星和干扰素联合应用后起到协同作用有关。Duchek等［10］对250例膀胱癌患者分别应用卡介苗和表柔比星+干扰素术后灌注，结果显示卡介苗组优于表柔比星+干扰素联合用药组，但干扰素能够与其他药物联合应用提高预防膀胱癌复发的疗效是肯定的。另外卡介苗膀胱灌注的不良反应也限制了其应用。本研究对联合应用吡柔比星和干扰素抑制大鼠膀胱癌生长进行了初步的观察，并就抑制微血管生长和促进肿瘤细胞凋亡进行了初步探讨，但仍需进一步深入研究，尤其是对机体和膀胱局部的免疫反应进行研究。

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