同种异型抗CD3单抗对细胞因子诱导的杀伤细胞体外扩增的影响

张 克，姜 维，周 建，陶 然，李溢柔，李 进，马世武*，侯金林

(1南方医科大学附属南方医院，广州 510515;2深圳源兴生物医药科技有限公司)

细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)已经应用于肿瘤的临床治疗［1，2］，其体外大量扩增及维持这些细胞的表型和功能，在过继免疫治疗中至关重要。目前体外活化人T细胞的抗CD3单克隆抗体主要包括鼠源性 IgG1(UCHT1)、IgG2a(OKT3)抗体。既往研究发现，同种异型抗CD3单克隆抗体体外刺激 T细胞的结果是不同的［3］，但在体外诱导CIK细胞方面是否存在差异尚不清楚。2011年1月，本研究观察了同种异型抗 CD3单克隆抗体(UCHT1、OKT3)体外扩增 CIK细胞，并比较其对CIK细胞扩增效率、细胞表型及功能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 淋巴细胞分离液(LymphoprepTM);IFN-γ、IL-1a、IL-2(PeproTech);UCHT1(RδD);OKT3(Cuba CJMAB S.A);PAA淋巴细胞培养液(PAA);CD3-FITC、CD56-PE、CD8-PE-Cy5(BD);25 cm2细胞培养瓶(Corning);CytoTox 96®非放射性细胞毒检测试剂盒(Promega);细胞培养箱(SANYO，MCO-20AIC);流式细胞仪(BD FACSCantoⅡ);细胞计数仪(CytometerTM，Nexcelom Bioscience);倒置相差显微镜(Nikon ELIPSE Ti)。

1.2 方法

1.2.1 CIK细胞的体外培养 采集7例健康青年志愿者外周静脉血20 ml，肝素抗凝。常规密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，细胞计数，加入含1%自体血浆及1000 U/ml IFN-γ的PAA培养基，接种于5 cm×5 cm细胞培养瓶中，细胞密度为2×106个/ml，培养基体积为 5 ml，37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h，共接种2瓶;第2天，两培养瓶中分别加入50 ng/ml UCHT1、OKT3，并同时加入100 U/ml IL-1α及1000 U/ml IL-2的PAA培养基，定期加入含1000 U/ml IL-2的PAA培养基，调整细胞密度为2×106个/ml。

1.2.2 细胞扩增倍数观察 应用数胞计数仪于培养后第3、7、10、12、14、21 天观察细胞形态并计数，计算细胞扩增倍数(扩增倍数=细胞密度×培养基体积÷接种细胞总量)。

1.2.3 CIK细胞表面标志检测 选取培养基线和培养第14天的CIK细胞，取1×106个细胞置于流式检测管中，1500 r/m离心5 min，洗涤细胞2次，加入流式单克隆抗体 CD3-PE、CD56-FITC和 CD8-PE-Cy5各10 μl，并设同型对照，4℃避光孵育30 min;1 ml PBS溶液离心洗涤2次，加入2%多聚甲醛200 μl重悬细胞并固定20 min，流式细胞仪分析。

1.2.4 细胞毒实验 按照试剂盒说明，均为3个复孔，调整CIK细胞密度为4×106/ml，取200 μl接种于96孔圆底板内，之后倍比稀释，细胞总量依次为4 ×105、2 ×105、1 ×105、0.5 ×105，调整K562 细胞密度为1×105/ml，取100 μl加入到实验孔，细胞总量1 ×104，实验孔效靶比分别为40∶1、20∶1、10∶1、5∶1，并设立效应细胞、靶细胞自释放孔，培养基、容积对照孔，靶细胞最大释放孔，每孔总体积为200 μl，250 g离心4 min，37℃、5%CO2细胞培养箱中培养4 h。反应停止前45 min，在靶细胞最大释放孔加入细胞裂解液 20 μl。250 g 离心 4 min，吸取上清 50 μl置于96孔平底板中，每孔加入显色液50 μl，室温避光30 min，加入终止液 50 μl，全自动酶联检测仪490 nm测各孔的吸光度A值。结果计算公式:杀伤率(%) =(A实验孔－ A效应细胞自释放孔－ A靶细胞自释放孔)/(A靶细胞最大释放孔－A靶细胞自释放孔) ×100%。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件，结果以表示，计量资料比较采用配对t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CIK细胞的体外增殖 两组对不同培养时间CIK细胞增殖倍数的比较见表1。

表1 UCHT1及OKT3对不同培养时间CIK细胞增殖倍数的比较()

表1 UCHT1及OKT3对不同培养时间CIK细胞增殖倍数的比较()

注:与 UCHT1组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

组别 n 第3天 第7天 第10天 第12天 第14天 第21天UCHT1 组 7 0.8 ±0.1 3.0 ±4.1 4.0 ±1.6 8.9 ± 4.7 13.3 ± 5.9 33.7 ± 20.9 OKT3 组 7 0.7 ±0.2 3.0 ±1.2 14.8 ±9.8* 39.9 ±36.1* 69.8 ±43.9＊＊ 470.9 ±451.9*

2.2 CIK细胞的表面标志 培养基线和第14天应用流式细胞染色发现，基线CD3+细胞频数为(57.30±10.40)%;第 14天时，OKT3组 CD3+细胞升至(95.13 ±4.49)%，UCHT1组升至(75.79 ±29.66)%，两组比较P＞0.05。基线CD3+CD8+细胞频数为(28.82±13.36)%;第 14天时，OKT3组C细胞升至(74.94 ±11.45)%，UCHT1 组升至(47.27 ±29.38)%，两组比较 P ＜0.05。基线细胞频数为(27.17 ±9.32)%;第 14 天时，OKT3组降至(16.24±13.96)%，而 UCHT1组升至(38.91 ± 25.23)%，两组比较 P ＜ 0.05。基线细胞频数为(6.00 ±5.66)%;第 14 天时，OKT3组升至(14.09±14.35)%，UCHT1 组升至(18.29±14.04)%，两组比较差异无统计学意义。基线细胞频数为(21.59 ±9.99)%;第 14天时，OKT3组降至(3.03±3.81)%，UCHT1 组为(21.87 ±28.82)%，两组比较 P ＞0.05。

2.3 CIK细胞对K562细胞的细胞毒作用 选取3例进行细胞毒试验，比较两组细胞对K562细胞的毒性作用。当效靶比分别为 40∶1、20∶1、10∶1、5∶1时，OKT3 组、UCHT1 组分别为(9.46 ±8.90)%vs(50.13 ± 14.00)%、(5.01 ± 5.02)%vs(44.65 ±11.63)%、(2.85 ±2.85)%vs(27.28 ±12.05)%、(1.18 ±1.18)%vs(11.84 ±10.48)%。当效靶比为20∶1时，两组比较 P=0.078，结果提示:对 K562的细胞毒作用，UCHT1组有高于OKT3组的趋势。其余各效靶比比较，虽然UCHT1组对K562的杀伤率均高于OKT3组，但均无统计学意义。

3 讨论

1991年Schmidt-Wolf在CD3激活的杀伤细胞基础上制备出了一类新型免疫细胞，即CIK细胞，CIK细胞是人外周血单核细胞在体外经多种细胞因子刺激后获得的异质细胞群，由于该细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，故又称为NK细胞样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和自然杀伤细胞非主要组织相容性复合体限制等特点。体外诱导、培养CIK细胞需要多种细胞因子，包括抗 CD3单抗、IFN-γ、IL-1a、IL-2等。目前应用较多的抗 CD3单抗为 UCHT1、OKT3。UCHT1及OKT3均为鼠源性抗CD3单克隆抗体，其中UCHT1是IgG1型抗体，而OKT3是IgG2a型抗体。OKT3、UCHT1是同种异型的单克隆抗体，通过与CD3分子紧密结合，识别CD3分子的ε亚基，从而活化T细胞［4，5］。尽管不同亚型的抗CD3单克隆抗体均作用于相同的CD3分子ε亚单位，但是由于Fc受体的不同，使得不同亚型的抗CD3单克隆抗体对T细胞的活化作用也不尽相同［6，7］。本研究比较同种异型的抗CD3单抗对CIK细胞的扩增倍数、表型及对K562细胞杀伤作用，寻找何种亚型的抗CD3单抗更适合体外诱导、培养CIK细胞。

我们研究发现，OKT3扩增CIK细胞总数明显高于 UCHT1，其主要成为 CD3+CD8+细胞，而相对细胞的频数较低。细胞毒试验显示，UCHT1组的杀伤效果较OKT3组有增强的趋势，这提示了CIK细胞中高比例的细胞可能较 CD3+CD8+对于杀伤肿瘤细胞更加重要。为此，获得高比例的细胞可能对CIK细胞培养是重要的。

过继免疫治疗一方面需要保证扩增细胞的数量，但更重要的是保证细胞的质量。本研究评价了两种不同亚型的抗CD3单克隆抗体对CIK细胞扩增的影响，不同亚型的抗CD3单克隆抗体对CIK细胞扩增效率、表型及细胞毒功能方面都是不同的。在应用CIK细胞作为过继免疫治疗时，在保证细胞扩增倍数的情况下，选择UCTH1能体外诱导出杀瘤活性更强的CIK细胞，因此更适合于体外培养CIK细胞。OKT3扩增CIK细胞数量多但功能弱的原因尚不清楚，今后应进一步探讨发生此现象的机制。

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