铜绿假单胞菌诱导巨噬细胞凋亡与细胞周期的关系

柴文戍，李 颖

(辽宁医学院附属第一医院，辽宁 锦州 121001)

铜绿假单胞菌(PA)是种植于支气管扩张、肺囊性纤维化和慢性阻塞性肺病患者下呼吸道的机会致病菌，可持续刺激宿主免疫反应导致进展性气道破坏，广泛存在于土壤、水及各种动物体内，具有多重耐药的特点［1］，一旦感染，临床治疗十分困难。肺巨噬细胞是肺组织细胞免疫的首道屏障，在肺部特异及非特异免疫系统中起重要作用。国内研究发现，PA 能诱导人类 U937 细胞发生凋亡［2，3］。随着细胞和分子生物学的发展，人们逐步认识到细胞周期不仅与细胞增殖直接相关，而且与细胞分化和凋亡有关［4］。然而，PA诱导J774细胞凋亡是否与细胞周期有关目前尚不清楚。2009年8月～2010年10月，我们通过流式单染技术检测细胞凋亡率和细胞周期，探讨PA感染宿主的发病机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 PA采用标准菌株ATCC27853，辽宁医学院第一附属医院检验中心惠赠，用LB培养基培养。J774巨噬细胞来源于鼠网状细胞肉瘤，由中国医学科学院协和医科大学基础医学研究所提供。培养基采用含10%FBS和100 U/ml庆大霉素的高糖型DMEM。Annexin V凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司，其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 细菌上清液的制备 在8 ml大豆肉汤培养基中通过振荡培养法(37℃，8 h)对PA进行增菌，5000 r/min 离心15 min 后，用孔径0.22 μm 的滤膜过滤，获得细菌上清液，最后灭火(56℃、1 h)，－20℃储存备用。

1.2.2 细菌感染细胞 将贴壁的J774细胞常规胰蛋白酶消化传代，接种于25 cm2的培养瓶中，置37℃、5%CO2培养箱中培养，隔2 d换液1次。生长基本融合的贴壁J774细胞弃培养基，加入2 ml含胎牛血清、不含抗生素的DMEM悬浮细菌液，使J774细胞与PA上清液以15%的浓度混合，37℃水浴中培养3、6、9 h后分别行J774细胞凋亡检测。同时将实验分为:①正常对照组(不含PA);②PA感染3 h组;③PA感染6 h组;④PA感染9 h组。

1.2.3 凋亡细胞检测 ①吉姆萨染色:与PA上清液共培养3、6、9 h后的J774细胞用PBS冲洗2遍，然后用甲醇室温固定5～7 min，干燥后用吉姆萨染液染色15 min，三蒸水冲洗3遍，空气中晾干，将盖玻片用纯甘油固定在载玻片上，用普通显微镜观察。②Annexin V/PI单染分析进行细胞凋亡率和细胞周期检测:取PA上清液作用0、3、6、9 h的细胞上流式细胞仪检测，按实验设计处理细胞后，用70%的冷乙醇固定，采用PI一步插入性DNA定量荧光染色法检测细胞周期和细胞凋亡率。

1.3 统计学方法 应用SPSS16.0统计软件，结果以表示，计量资料比较采用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞形态观察 吉姆萨染色结果显示，感染3 h组细胞膜完整但出现发泡现象，感染6 h组出现凋亡细胞的染色质浓缩、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。感染9 h组细胞出现皱缩、变圆，可见凋亡小体。随着感染细胞时间的延长，各实验组的凋亡细胞逐渐增多，对照组则不受影响。

2.2 细胞凋亡率和细胞周期检测结果比较 PA上清液对J774细胞有明显的抑制生长的作用，流式细胞图可见典型的亚二倍体凋亡峰，细胞周期分布显示，9 h内S期细胞随时间延长而减少，G0/G1期细胞逐渐增多，凋亡率也增加。各实验组与对照组比较均有统计学差异(P均＜0.01);各实验组间比较亦有统计学差异(P均＜0.01)。见表1。

3 讨论

目前，研究细胞凋亡与细胞周期的关系已成为热点。本实验以吉姆萨染色及流式单染技术研究了PA上清液对J774细胞凋亡的诱导作用，发现PA上清液能诱导 J774细胞发生凋亡，与国外研究一致［5］。通过吉姆萨染色观察细胞形态学改变，感染3 h组细胞膜完整但出现发泡现象，感染6 h组出现凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。感染9 h组细胞出现皱缩、变圆，可见凋亡小体。且随着J774细胞感染时间延长，凋亡的J774细胞增多。根据流式单染技术证实，S期细胞随时间延长而减少，G0/G1期细胞渐增多，凋亡率也增加。提示PA以时间依赖方式诱导人J774细胞凋亡，同时说明PA诱导J774细胞凋亡与细胞周期有关。

表1 PA上清液对J774细胞周期分布和凋亡的影响(n=5，%，)

表1 PA上清液对J774细胞周期分布和凋亡的影响(n=5，%，)

注:与0 h比较，*P ＜0.01;与3 h比较，#P ＜0.01;与6 h比较，★P ＜0.01

检测指标0 h 3 h 6 h 9 h细胞周期G0/G1 57.90 ±1.0062.90 ±0.79* 68.34 ±0.87*# 72.54 ±0.50*#★S 30.82 ±0.6826.49 ±0.63* 20.19 ±0.84*# 11.70 ±0.62*#★G2/M 11.26 ±1.0010.62 ±1.41 11.47 ±0.73 15.76 ±0.27*#★凋亡率 2.78 ±0.3512.44 ±0.56* 30.82 ±0.83*# 41.79 ±1.03*#★

细胞周期是一个动态过程，每个分期互相联系，不可分割。按DNA合成、分裂过程分为合成前、合成期、合成后期和分裂期，即G0/G1、S、G2和M 期，M期细胞一分为二。影响细胞周期的外界因素如生物、理化因素及缺氧、营养不良等，都可导致细胞周期的各种改变如G1期阻滞、S期蓄积、G2期阻滞和M期延缓等［6］，造成细胞增殖发生障碍。细胞周期的改变既是受损的结果，也是自我保护的表现，周期暂时停止进程，会避免错误即受损的DNA复制、分裂，直至缺陷得以纠正，细胞才会顺利进入下一时相［7］。较小的DNA损伤引起细胞周期停滞，而较严重的DNA损伤使得细胞凋亡。一些关键的细胞周期调控蛋白也参与细胞凋亡的调节，提示细胞周期和细胞凋亡存在一个协调的机制。有研究证明，饱和脂肪酸棕榈酸可促进细胞凋亡，抑制细胞增殖，且作用呈时间与剂量依赖性。其机制为使细胞周期阻滞于G0/G1期，降低S期细胞比例。提示饱和脂肪酸棕榈酸抑制细胞的增殖是通过G0/G1期向S期的转换，阻滞细胞周期进程，影响其复制。

流式细胞仪可通过观察整个细胞周期DNA含量的变化来分析细胞的凋亡。整个复制周期可以描述为G0/G1、S、G2/M。本研究通过流式单染技术，证明PA上清液能诱导J774细胞凋亡，且与细胞周期有关，具有统计学意义。在细胞调控中，G1～S期调控点是细胞内外信号传递、整合汇集到细胞核对细胞增殖进行调控的关键点［8］。

综上所述，PA上清液能诱导J774细胞凋亡，且与细胞周期有关。因此，寻找调节G1～S期调控点的药物，对临床抑制PA感染具有良好的前景。

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［4］朱小敏，柴文戍.铜绿假单胞菌感染诱导U937细胞凋亡的研究［J］.中国病原生物学杂志，2008，3(4):263-265.

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［8］崔巍，黄葶，刘均利，等.饱和脂肪酸对胰岛β细胞凋亡和细胞周期进程的影响［J］.西安交通大学学报，2009，30(3):301-306.