骨髓增生异常综合征的免疫表型和SURVIVIN、P15INK4B、TRF1基因表达

杨 力，姜胜华，胡彩华，徐瑞容，丁润生，尤学芬，秦 燕，刘 红

(南通大学附属医院，江苏 南通 226001)

骨髓增生异常综合征(MDS)是一组异质性造血干细胞克隆性疾病，其主要特征为无效造血所致的难治性血细胞减少、骨髓病态造血和具有发展成急性白血病的高危倾向。由于细胞增殖和分化异常，骨髓细胞表面标志常异常表达，免疫表型、基因表达多有异常。近年来，我们分析了50例MDS免疫表型，并检测其SURVIVIN、P15INK4B、TRF1基因mRNA表达情况。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2006年12月～2011年2月我院住院及门诊患者50例，均根据WHO 1997标准诊断并分型，男28例、女22例，年龄21～83岁、中位年龄63岁。其中，难治性贫血(RA)23例，RA伴有环状铁幼粒细胞4例，RA伴多系发育异常11例，RA伴原始细胞增多12例。根据IPSS分期，50例患者中，低危25例，中危10例，高危15例。对照组30例，男17例、女13例，年龄26～76岁、中位年龄55岁;为正常体检者、再生障碍性贫血以及特发性血小板减少性紫癜患者。

1.2 方法

1.2.1 细胞表面标记检测 抽取MDS治疗前患者和对照组骨髓 1～2 ml，EDTA-K2抗凝。采用CD45/SSC双参数散点图设门识别幼稚细胞群、成熟粒细胞群和成熟单核细胞群。采用美国BD公司流式细胞仪测定不同细胞群的分化抗原表达情况。标准单克隆抗体包括藻红蛋白、异巯氰酸荧光素标记的 CD34、CD7、CD13、CD33 、CD11b、CD117 及同型对照等均购自美国BD公司。磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.2 ～7.4)稀释后调节细胞浓度至(2 ～5)×107/ml，室温下进行单克隆抗体标记。各试管内先加入不同单克隆抗体组合，再加入100 μl调整浓度后的单细胞悬液，充分混匀。然后加入2 ml红细胞裂解液，离心(1500 r/min)5 min，去上清，PBS洗涤1次，PBS固定上机检测。每次检测各种荧光素均设定相应抗体的同型阴性对照。

1.2.2 细胞RNA抽取及RT-PCR 收集骨髓单个核细胞提取RNA(Trizol法提取)，在紫外分光光度计下测定RNA的OD值(OD值在1.6～2.0时可进行下一步实验)，调节 RNA浓度为1 μg/μl备用。RT-PCR 步骤采用两步法，反应体系 RNA 5 μg、0.5 μg/μl Oligo(dT)1 μl、5 × reactiong buffer 4 μl、RNase inhibitor(20 U/μl)1 μl，dNTP mix(10 mmol/L)2 μl 和 RevertAidTMM-Mulv reverse transcriptase(200 U/μl)1 μl，总体积 20 μl。PCR 体系包括 cDNA 2 μl，上下游引物(10 pmol/μl)各 2 μl，dNTP mix(10 mmol/L)0.8 μl，10 × Taq buffer 5 μl，Taq酶(25 U/μl)0.5 μl和 MgCl2(25 mmol/L)。反应条件:β-actin mRNA(591 bp)上游引物 5＇-AAGTACTCC GTGTGGATCG G-3＇，下 游 引 物 5＇-ATCCTATC ACC TCCCCTGTG-3＇;94 ℃预变性 5 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延40 s，共计22次循环，最终72℃延伸5 min。SURVIVIN mRNA(309 bp)上游引物 5＇-CTTTCTCAAGGACCACCGCATC-3＇，下游引物 5＇-CAATCCATGGCAGCCAGCTGC-3＇;扩增条件为94℃变性2 min后，94℃ 45 s，61℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循环 40次。P15INK4B mRNA(450 bp)上游引物 5＇-TGGGGGCGGCAGCGATGAG-3＇，下游引物 5＇-AGGTGGGTGGGGGTGGGAAAT-3＇;94℃ 预变性5 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸40 s，共计30次循环，最终72℃延伸5 min。TRF1 mRNA(499 bp)上游引物 5＇-CCTCAGACAGCGAAGACTGA-3＇，下游引物 5＇-GCCTGTAATCCGAGCTACTCA-3＇;首先94℃预变性5 min，然后94℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共扩增35个循环，最后72℃再延伸7 min。PCR产物5 μl，与DNA marker在1.8%琼脂糖凝胶上电泳分离，电压100 V，电流60 mA。30 min后将凝胶置于四星图像分析仪中摄像，PCR条带的密度采用Scion image图像分析软件半定量分析。

1.3 统计学方法 用Stata 7.0软件，计量资料以表示，行单因素和两因素方差分析以及方差齐性检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MDS患者骨髓细胞免疫表型 与对照组相比，MDS患者骨髓细胞原始群 CD45表达下降，CD34表达增多;粒细胞群CD34表达增多，CD13、CD33、CD11b表达下降，单核细胞表达 CD117和CD34。见表1。

2.2 SURVIVIN、P15INK4B、TRF1基因mRNA表达 与对照组相比，MDS患者骨髓单个核细胞SURVIVIN和 TRF1基因 mRNA表达增加，P15INK4B基因mRNA表达下降(P均＜0.05)。从低危组到高危组，SURVIVIN基因和TRF1基因mRNA表达增加，P15INK4B基因表达下降(P均＜0.05)。见图1 ～3。

表1 MDS患者和对照组骨髓细胞各抗原表达(%，)

表1 MDS患者和对照组骨髓细胞各抗原表达(%，)

注:与对照组相比，*P ＜0.05

组别 n 原始细胞群CD7 CD34粒细胞群CD13 CD33 CD11b CD34单核细胞群CD117 CD34对照组 30 0.9 ±0.5 1.0 ±1.2 24.2 ±2.1 15.3 ±2.6 80.2 ±3.4 1.2 ±0.7 4.3 ±1.5 4.1 ±2.1 MDS 50 3.2 ±1.6* 9.6 ±2.5* 17.0 ±2.9* 11.2 ±1.4* 56.2 ±2.4* 11.3 ±1.1* 1.2 ±2.1* 0.9 ±0.9*

3 讨论

图1 SURVIVIN mRNA表达

图2 TRF1 mRNA表达

图3 P15INK4B mRNA表达

大量研究表明，多参数流式细胞术有助于MDS诊断和预后评价［1］。我们研究发现MDS患者原始细胞群CD7和CD34高表达;粒细胞群CD34表达增多，CD13、CD33、CD11b表达下降;单核细胞表达CD117和 CD34。Ogata等［2］研究发现，CD7 在高危MDS中通常阳性，表达随MDS进展而增加，提示临床预后差，可以作为MDS不良预后相关的独立因素。原始细胞群高表达CD34，对MDS诊断有特征性［3］，表达水平与疾病进展明显相关，表达增高者预后较差，易转化为白血病，生存期短。粒细胞群CD34表达增多，CD13、CD33、CD11b表达下降，提示细胞成熟障碍。Ogata等［4］发现MDS粒细胞群的趋化、游走、黏附及吞噬功能减弱，临床表现为病态造血严重，常常出现感染。CD117即干细胞生长因子受体，其表达随着向终末成熟血细胞分化而逐渐下降，单核细胞发育早期即失去表达CD117。MDS患者单核细胞CD117表达可增高，CD117表达率和疾病进展有关，与其他免疫表型异常相比，CD117表达增高对于诊断MDS的特异性较高。同样单核细胞发育早期也失去表达CD34，CD34表达也是MDS诊断的特异指标［5］。

SURVIVIN是近来发现的凋亡抑制蛋白(IAP)家族成员，它不仅具有抑制细胞凋亡的功能，而且参与了细胞增殖分化的调控，与一些肿瘤的预后相关，并且和MDS发病进展密切相关。其中SURVIVIN通过与CDK4相互作用形成SURVIVIN/CDK4复合体，使CDK2/cyclinE激活、Rb磷酸化，导致p21从其与CDK4的复合体中释放出来，并与线粒体的procaspase-3作用以抑制Fas介导的凋亡。蔡真等［6］发现，MDS患者SURVIVIN mRNA总阳性率高于正常对照组，高危组阳性率高于低危组，即随着MDS的进展，SURVIVIN mRNA的表达率随之增高。我们研究也同样证实，与对照组相比SURVIVIN基因在MDS患者中高表达，且与预后有关。

P15INK4B基因产物被认为是细胞周期蛋白DCDK4/6复合物的抑制物，细胞周期蛋白D-CDK4/6复合物可磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白(RB蛋白)而导致转录因子的释放，启动细胞通过G1期限制点由G0期或G1期进入S期。P15INK4B表达增强，在MDS负向调节造血细胞增生和阻止其恶性转换、促进分化中起重要作用［7］。本研究也证实P15INK4B基因在MDS患者中低表达，且和MDS预后分级相关。TRF1是第1个被发现的哺乳动物的端粒相关蛋白，它与端粒双链DNA结合，改变端粒的结构，阻止端粒酶与端粒的结合，从而阻止端粒的延长。MDS患者端粒长度缩短与IPSS危险度分层有显著相关性，端粒长度缩短组的MDS患者有更低的血红蛋白浓度，更差的细胞遗传学改变和预后。TRF1作为端粒长度的负性调节因子，是揭示MDS预后不良的因素之一［8］。我们研究结果也同样证实了这一点。

MDS早期常很难诊断，不易和再生障碍性贫血、免疫相关性全血细胞减少等疾病鉴别。和国内外其他研究一样，我们研究发现MDS细胞免疫分型有其特征性，且有基因的异常表达，此可能成为MDS辅助诊断的指标之一。

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