端粒DNA损伤修复机制及其意义

朱先玉，李江辉 综述 毛苹苏 审校

西南医科大学基础医学院肿瘤医学研究所（泸州 646000）

端粒（telomere）是真核生物线性染色体末端的特殊结构，具有保护染色体和维持基因组稳定性的功能。哺乳动物正常体细胞不具有端粒酶活性以及端粒延伸替代机制。由于DNA 末端复制问题（end-replication problem），端粒随着细胞增殖而不断缩短。当端粒长度不足以维持基因组稳定时，细胞出现复制性衰老（replicative senescence）。细胞衰老与个体衰老紧密相关，是个体衰老的重要基础。据《2021世界卫生统计报告》统计全球平均预期寿命73 岁，中国平均预期寿命约77岁，人口老龄化问题日渐严重。许多疾病的发生发展与年龄密切相关，比如心血管疾病、神经退行性疾病等。如何延长健康寿命，缓解衰老，这是衰老领域亟待研究的问题。DNA损伤对维持基因组稳定具有重大威胁，端粒如何应对DNA 损伤，将为衰老领域研究提供重要理论依据。

一直以来，肿瘤对人类健康造成严重影响。虽然当前治疗手段众多，但在部分肿瘤治疗中，依然存在治疗效果不理想的问题，更多新治疗靶点的研究迫在眉睫。肿瘤细胞具有无限增殖的能力，其端粒长度的维持依赖于端粒酶（telomerase）或者端粒延伸替代机制（alternative lengthening of telomere，ALT）。绝大多数肿瘤细胞的端粒长度维持依赖于端粒酶，约15%肿瘤细胞采用ALT 机制维持端粒长度。端粒酶阴性肿瘤（ALT肿瘤）由于预后差、侵袭性强等特点，其治疗存在一定难度，有待开展更深入的研究。ALT 机制以一种类似同源重组的方式进行，而同源重组是DNA 损伤修复的重要途径。肿瘤细胞中端粒延伸方式是肿瘤防治的重要靶点，研究端粒DNA 损伤修复为肿瘤的防治，特别是端粒酶阴性肿瘤的治疗，提供重要的理论依据和应用前景。

本文将围绕端粒DNA 损伤修复展开论述，介绍端粒如何平衡末端保护与DNA 损伤修复，并探讨端粒DNA损伤修复在衰老与肿瘤防治中的重要意义。

1 DNA损伤修复与端粒

1.1 DNA损伤修复

DNA 损伤可以由外源因素和内源因素引起，外源因素包括电离辐射、UV照射、化学药物等，内源因素则包括DNA 复制错误、ROS 氧化性损伤等[1-2]。常见的DNA损伤修复包括碱基切除修复（base excision repair，BER）、核苷酸切除修复（nucleotide excision repair，NER）、错配修复（mismatch repair，MMR）、单链断裂损伤修复（single-strand break repair，SSBR）以及双链断裂损伤修复（double-strand break repair，DSBR）等方式。

在所有的损伤中，DNA 双链断裂是最具有细胞毒性的损伤类型，因此，双链断裂损伤修复对于细胞的存活至关重要。DNA 双链断裂主要有两种修复方式：同源重组（homologous recombination，HR）和非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）[3]。同源重组是一种精确的修复方式，主要发生在细胞S期和G2期，DNA 末端剪切（end resection）是同源重组中非常重要的过程。首先，损伤位点先经过末端剪切产生一段3'悬突单链DNA，该单链DNA 被单链结合蛋白RPA 保护，紧接着RAD51结合在单链DNA上进行同源序列的搜寻，并与同源区形成D环。最后，DNA聚合酶以姐妹染色单体上同源序列为模板延伸DNA，进而完成修复[4]。NHEJ 可以发生在细胞周期各个时期，分为经典非同源末端连接（C-NHEJ）与替代型非同源末端连接（A-NHEJ），该修复方式可能会引起DNA插入、缺失等错误[4]。

1.2 端粒的特殊结构

端粒由端粒DNA 和结合蛋白shelterin 复合体组成。端粒DNA富含鸟嘌呤，在哺乳动物中端粒DNA由以TTAGGG 为单位的串联重复序列组成。端粒DNA包括双链DNA和末端单链DNA两部分，端粒末端单链DNA 被称为G-overhang。shelterin 复合体主要由TRF1、TRF2、RAP1、TIN2、TPP1、POT1 六种蛋白组成。TRF1和TRF2结合端粒双链DNA区域，POT1结合端粒单链G-overhang，TPP1 与TIN2 介导蛋白之间相互作用，RAP1与TRF2蛋白结合。端粒DNA 在蛋白复合体shelterin 帮助下形成T 环（T-loop），参与染色体末端保护[5]。

端粒G-overhang在招募端粒酶延伸端粒以及形成T环中具有重要的作用，G-overhang的产生和维持受到了严格的调控。由于DNA 半保留复制和半不连续复制的特性，端粒DNA 在复制时分前导链和后随链进行。复制后前导链的末端近乎平末端，而后随链末端随着引物的降解，留下一段短的单链DNA。Goverhang的形成大致分为三个步骤，首先Apollo 核酸酶处理前导链的平末端，形成短的单链DNA，若Apollo缺失，端粒前导链可导致ATM 激活，并引起端粒末端连接[6]，而对后随链来说，原本存在短单链DNA，Apollo处理是非必需的；紧接着Exo1 核酸外切酶进行末端剪切，形成一段较长的单链DNA；最后CST复合体和聚合酶参与端粒DNA 单链的填补，确保overhang 维持到一定的长度，避免发生过度剪切[7-9]。最终端粒DNA末端形成50～500 bp长度的3'G-overhang。

1.3 端粒末端保护与DNA损伤修复之间的关联

端粒G-overhang 的产生依赖于核酸外切酶，与同源重组末端剪切过程极为类似。端粒末端DNA 与同源重组中间产物具有高度相似性，那么细胞如何做到染色体末端不会被识别为双链断裂损伤？研究发现在端粒蛋白的协同保护下，端粒末端单链DNA 将插入到端粒双链DNA 中，与DNA 链互补形成D 环，整个的端粒末端结构形成T-loop[10]。该特殊结构能避免端粒末端直接暴露，避免其被识别为DNA 损伤，防止DNA 损伤信号通路激活[11-12]。T-loop 受到细胞周期严格的调控，细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）通过磷酸化TRF2（Ser365）调控T-loop。在S 期，TRF2 发生去磷酸化，招募解旋酶RTEL1 到端粒上，使T-loop 瞬时被RTEL1 打开，进而促进DNA复制[13]。当细胞处于非S期，TRF2 被CKD2磷酸化，RTEL1与端粒DNA解离，T-loop重新形成并保护端粒[14-15]。

端粒结合蛋白在抑制DNA 损伤信号通路中具有重要作用，其中TRF2 尤其重要。TRF2 可抑制ATM 信号通路激活，阻止端粒发生末端融合[16-17]。TRF2 具有一个特殊结构域，即iDDR 结构域。该结构域可抑制RNF168泛素连接酶的汇聚，从而阻止双链断裂损伤反应的激活。当细胞缺失TRF2 时，细胞出现DNA 损伤反应，激活ATM信号通路，发生端粒末端的融合，最终导致端粒功能紊乱。此外，TRF2 结合蛋白RAP1 在抑制非同源末端连接中也具有一定的作用。传统观念认为TRF2在保护端粒上起着不可或缺的作用。然而，最新研究发现，在多能干细胞中，TRF2 在端粒末端保护中并不是决定性因素。在小鼠胚胎干细胞中敲除TRF2会引起轻微的DNA损伤反应，但端粒不会发生末端连接。同时，胚胎干细胞中端粒T-loop 的形成不依赖TRF2，当TRF2 缺失时，T-loop 依然可以形成，只有去除整个shelterin 复合体后，端粒才会出现功能紊乱[18-19]。在胚胎发育早期，TRF2 在端粒保护上是非必需的，但随着胚胎早期发育的完成，端粒保护切换到依赖于TRF2。该发现将端粒末端保护的认知进一步完善，并将端粒保护与细胞分化联系起来。除了TRF2/RAP1，POT1也可通过抑制RPA结合端粒，避免ATR信号通路被激活。当POT1/TPP1 缺失时，ATR 信号通路被激活，端粒末端DNA 发生过度剪切，端粒单链DNA信号明显增强[20-21]。由此可见，端粒结合蛋白通过不同的方式抑制DNA 损伤信号通路，继而实现对端粒的保护[22-23]。

DNA损伤修复的蛋白在端粒稳定性维持上具有重要作用。DNA-PK复合体是DNA双链断裂损伤修复的重要组分，由Ku 蛋白和催化亚基DNA-PKcs 组成，主要参与NHEJ。研究发现Ku70/80异二聚体与端粒结合蛋白（如TRF1、TRF2 以及RAP1）存在相互作用，DNAPKcs也可与TRF2和RAP1互作，他们之间的互作避免端粒发生末端连接[24-26]。原本参与NHEJ的重要蛋白，当结合在端粒上时其功能被抑制，这是由于TRF2 与Ku70蛋白α5结构域相互作用，而Ku70蛋白α5结构域是NHEJ所必需的。此外，在小鼠中，Ku蛋白的缺失可能导致端粒长度异常和末端融合，该末端融合可能依赖A-NHEJ，揭示Ku 蛋白结合端粒在防止染色体末端融合中起到一定作用[27]。除此之外，参与同源重组修复的蛋白MRN 复合体（MRE11、RAD50 以及NBS1）在端粒维持中也具有一定功能。MRN 复合体影响端粒结合蛋白TRF1 在端粒上的结合，从而调控端粒长度。MRN 复合体中NBS1 蛋白可在特定细胞周期与TRF2结合，参与端粒调控。CDK2介导的NBS1磷酸化，可调控NBS1与TRF2的结合。NBS1当发生去磷酸化时，不再与TRF2相互作用。最新研究发现MRE11类泛素化UFM1 修饰（UFMylation）在维持端粒稳定上有重要作用。UFM1是近年鉴定出的类泛素蛋白，UFMylation 修饰过程类似于泛素化。MRE11在缺乏UFMylation修饰时，不能被招募至端粒，最终导致端粒长度丢失[28]。端粒与DNA 损伤修复之间的关系错综复杂，一方面端粒末端需要避免识别为DNA损伤，阻止DNA损伤应答信号的激活，另外一方面端粒的维持依赖于DNA 损伤修复蛋白的参与，细胞如何精准平衡这个关键点？损伤修复蛋白如何在端粒保护和DNA 损伤应答中自由切换？这些都有待进一步研究。

2 端粒DNA损伤与修复机制

2.1 端粒DNA双链断裂损伤修复机制

传统观念认为端粒末端保护能避免染色体末端发生HR 和NHEJ。然而，DNA 双链断裂是具有最强细胞毒性的损伤，若修复不当，可能引起基因组紊乱甚至细胞的死亡。当端粒内部发生DNA 双链断裂时，细胞是否会修复？细胞将如何平衡末端保护与端粒内部损伤修复？本课题组之前的研究发现在增殖细胞中，端粒DNA 双链断裂可以被修复，该修复机制依赖于同源重组。随后有研究人员也提出端粒DNA 双链断裂损伤修复的确依赖于HR，同时提出了一种新的修复方式，即PARP1/Lig3介导的替代型非同源末端连接[29-31]。端粒DNA双链断裂修复是如何调控？有研究发现ATRX可调控端粒双链断裂，小鼠胚胎成纤维细胞中ATRX的缺失，导致ALT 标志物APBs 的增多、端粒姐妹染色单体交换频率的增加[32]。在DNA双链断裂损伤中，CNHEJ是重要的修复方式，在G1期主要是以C-NHEJ为主。当C-NHEJ 受到抑制时，A-NHEJ 可参与损伤修复，A-NHEJ 主要为微同源介导的末端连接（MMEJ）。然而，当前研究发现，C-NHEJ并不参与端粒DNA双链断裂修复。有趣的是，A-NHEJ 却在端粒DNA 损伤时激活并参与修复，提示端粒内部损伤发生时C-NHEJ仍然受到严格调控。目前，端粒DNA 损伤修复调控机制的研究尚少，需要开展更多的研究来揭示参与端粒DNA 双链断裂修复的蛋白调控机制。此外，端粒结合蛋白是否参与双链断裂修复方式的抉择，目前也尚不清楚。

同源重组修复需要复制产生的姐妹染色单体提供同源序列作为模板，因此同源重组修复主要发生在S/G2 期。当然，同源重组的调控不只局限于模板，还依赖于损伤修复蛋白的翻译后修饰，比如磷酸化修饰、泛素化修饰等。参与同源重组的蛋白MRE11、CtIP 以及BRCA1 需要被磷酸化，进而促进与下游蛋白的结合或酶活性的提升[33]。RAD51 与DNA 的结合和解离也参与调控双链断裂修复[34]。此外，同源重组蛋白的表达还可能受到细胞周期的调控，在G1 期低表达，在S/G2期高表达[16]。由于端粒DNA 序列为串联重复序列，端粒DNA 同源重组是否同样局限于S/G2 期发生？在G1期发生端粒DNA双链断裂，细胞会如何应对端粒DNA损伤？最近研究表明，在G1期诱导端粒DNA双链断裂损伤后，端粒DNA损伤位点没有检测到DNA损伤标志物53BP1 的出现，同时研究人员也未找到同源重组和非同源末端连接发生的证据[35]。该研究表明端粒同源重组修复依然受到各种因素的综合影响及调控，端粒DNA同源重组很可能限定在S/G2期，与基因组其他位点双链断裂修复相同。

2.2 端粒DNA氧化性损伤及修复机制

氧化性损伤可产生多种DNA 损伤类型，包括碱基损伤、核苷酸损伤以及单链断裂等，威胁基因组稳定。端粒DNA 由于富含鸟嘌呤，易受到氧自由基的攻击，氧化性损伤修复对于端粒维持正常的功能至关重要。众所周知，8-氧鸟嘌呤（8-oxoguanine，8-oxoG）是最常见的一种氧化性损伤类型。之前研究表明，碱基损伤主要通过碱基切除修复。首先DNA 糖基化酶（glycosylase）识别和水解损伤的碱基，产生一个无嘌呤或无嘧啶位点（即AP位点）。然后AP核酸内切酶切割DNA链，PARP1、XRCC1 和聚合酶参与损伤修复，最后连接酶进行连接[36]。DNA 糖基化酶包括OGG1、NEIL1、NEIL2、NEIL3、NTHL1、UNG、TDG等，不同的DNA糖基化酶对应不同的碱基损伤。

8-氧鸟嘌呤DNA 糖基化酶（8-oxoguanine-DNA glycosylase，OGG1）是8-氧鸟嘌呤损伤修复中主要的糖基化酶。端粒DNA 是活性氧自由基的重要靶点，这将影响端粒稳态和基因组稳定性，细胞将如何应对端粒DNA 氧化性损伤？研究人员通过不同的方法在端粒DNA 上诱导鸟嘌呤氧化性损伤，探讨氧化性损伤对端粒稳定性的影响[37-38]。有研究通过KillerRed-TRF1 系统在端粒DNA上诱导产生ROS，从而引起氧化性损伤。该系统可引起端粒DNA出现8-oxoG，结果显示24 h后端粒上大量的8-oxoG 损伤得到修复。随后，研究人员通过开发化学光遗传学系统针对性地在端粒区域产生单线态氧（singlet oxygen，1O2），从而特异性地在端粒DNA 上产生8-oxoG，研究氧化性损伤对端粒以及细胞的影响。在OGG1缺失的细胞中，8-oxoG会增加，进而端粒发生丢失，揭示OGG1 在端粒氧化性损伤中具有重要作用。当端粒DNA 反复地暴露在氧化自由基下时，细胞生长将受到抑制，端粒长度进一步缩短[38]。综上所述，端粒鸟嘌呤氧化损伤可以修复，修复机制为碱基切除修复，该过程依赖糖基化酶OGG1。此外，目前发现NEIL3 以及NTH1 也参与端粒碱基修复。NEIL3蛋白在S 期时表达量上升，受到TRF1 招募，结合于端粒DNA。当发生氧化损伤时，NEIL3 蛋白在端粒的结合将增强。当敲低NEIL3 表达时，端粒发生丢失以及末端连接，出现端粒功能紊乱。NEIL3 通过BER 途径在S/G2期促进端粒DNA氧化损伤的修复[39]。NTH1则主要识别嘧啶氧化性损伤，如5-OH-Cyt，5-OH-Ura，Tg 等。在小鼠胚胎成纤维细胞中，当NTH1 糖基化酶缺失时，细胞氧化性损伤修复变慢，端粒DNA 损伤信号增加，导致端粒不稳定[40]。

除了碱基损伤，活性氧自由基还可诱导端粒DNA单链断裂。抗氧化酶PRDX1（peroxiredoxin）参与修复活性氧诱导的端粒DNA 单链断裂。当细胞缺失PRDX1时，端粒DNA单链断裂不能有效地修复从而累积，这将对增殖细胞端粒长度造成威胁。当DNA 复制时，该单链断裂可转变成双链断裂，进一步引起端粒不稳定[41]。另外，活性氧自由基诱导的端粒双链断裂和单链断裂，可诱导产生R-loop，R-loop 的形成依赖于TRF2和TERRA。修复蛋白CSB与RAD52结合到端粒的R-loop 上，招募POLD3，细胞通过损伤诱导DNA 复制（break-induced DNA replication，BIR）的方式进行修复[42]。

3 端粒DNA 损伤修复研究在衰老和肿瘤防治中的意义

3.1 端粒DNA损伤修复与衰老

衰老是一个复杂的过程，伴随着整体功能减退，细胞衰老是个体衰老的基础。端粒功能紊乱、持久DNA损伤反应、癌基因激活可导致细胞衰老，细胞衰老分为复制性衰老、致癌基因诱导衰老以及压力诱导衰老[43-44]。DNA 损伤是压力诱导衰老的主要驱动力，损伤修复缺陷引起细胞衰老[45]。端粒随着细胞分裂逐渐变短，当缩短到一定程度，可诱导细胞衰老，即复制性衰老。端粒由于其特性，易发生DNA 损伤，损伤若不能修复，将导致压力诱导的细胞衰老，端粒功能紊乱与衰老及衰老相关疾病紧密相联[46]。有研究发现氧化性损伤随着年龄的增加而增加，一方面由于抗氧化能力下降，另一方面可能与衰老细胞中DNA 损伤修复能力下降有关[47]。在之前研究中发现在增殖细胞中，端粒DNA 双链断裂可以被修复，然而不管在复制性衰老还是压力诱导衰老细胞中，端粒DNA 损伤都不能被修复。这与之前研究报道相符，之前发现在衰老细胞中，端粒上出现持久性的DNA损伤信号[48]。端粒由于序列的特殊性，8-oxoG是其常见的DNA损伤类型。在最新的研究中，研究人员特异性地诱导产生端粒8-oxoG，该损伤足以引起正常细胞的快速衰老[49]。短期急性DNA损伤虽未引起端粒的缩短，但是其激活端粒DNA 损伤信号和p53 通路，引起细胞衰老，而长期慢性的端粒DNA损伤则会引起端粒缩短。进一步开展端粒损伤修复调控的研究，将为缓解衰老细胞中端粒损伤的程度提供理论依据，从而促进基因组稳定。

除了随着年龄增长出现的衰老，还存在儿童时期出现加速衰老的疾病，即早老症（Hutchinson-Gilford Progeria syndrome，HGPS），患病儿童存活止于青少年时期[50]。早老症是一种常染色体显性遗传疾病，患者出现皮肤色素沉着、骨质疏松、动脉粥样硬化等症状。该疾病是由于核纤层蛋白LMNA 基因发生突变，细胞表达一个突变的毒性蛋白progerin。该蛋白可引起核形态异常、基因表达调控失常、DNA 损伤修复缺陷、端粒紊乱以及基因组不稳定等问题[51-53]。有研究发现端粒DNA双链断裂可诱导产生长非编码RNA，长非编码RNA 进一步加工为短的非编码RNA。这些非编码RNA 在端粒DNA 损伤反应激活中具有重要作用[54]。特异结合该非编码RNA 的寡聚核苷酸可减少DNA 损伤以及延缓细胞衰老。通过HGPS模型，抑制端粒非编码RNA 可观察到早衰模型中小鼠寿命的延长。这类疾病的研究可以为儿童早老症提供治疗依据，同时为干预生理性衰老提供启示。

3.2 端粒DNA损伤修复与肿瘤治疗

端粒与端粒酶在肿瘤的发展以及治疗中扮演着重要角色。端粒酶抑制剂可靶向端粒酶阳性肿瘤进行治疗，目前已经有相关药物作用于该靶点[55]。同时，靶向端粒治疗肿瘤的药物也有开发。6-硫代-2'-脱氧鸟苷（6-thio-2'-deoxyguanosine，6-thio-dG）是一种核苷类似物，在端粒酶合成DNA 时插入端粒DNA 中，形成端粒DNA 损伤，激活免疫通路，促进免疫细胞对肿瘤细胞的识别，帮助克服肿瘤治疗中PD-L1 阻断剂耐药性的问题[56]。此外，由于端粒酶阴性肿瘤具有更高的转移性和侵袭性，却又缺乏特异性靶点，这类肿瘤的治疗靶点有待进一步研究。端粒酶阴性肿瘤细胞的端粒延伸替代机制是类似同源重组的方式，但其具体机制尚不清楚。端粒DNA 双链断裂可通过同源重组修复，通过研究端粒DNA 双链断裂损伤修复机制及调控方式，有助于揭示ALT 机制，进而为ALT 肿瘤的治疗提供重要依据和研究基础。本课题组之前的研究发现端粒同源重组可以在姐妹染色单体和非姐妹染色单体之间发生，非姐妹染色单体的同源重组可引起端粒的延长以及长度异质性[29，57]。当长时间暴露在端粒DNA双链断裂下，端粒酶阳性细胞可出现ALT标志物，如APBs，Ccircle 和C-overhang 等。端粒酶与ALT 机制之间转换的相关研究，可能有助于开发肿瘤靶向药物和解决耐药性的问题。端粒DNA 双链断裂损伤修复的调控，更多的相关研究有待开展。

氧化性损伤作为一种常见的损伤类型，影响端粒稳定性。当端粒酶阳性细胞中发生氧化性损伤时，氧化损伤的碱基导致端粒酶不能正常延伸端粒。此时，抗氧化酶PRDX1可以富集在端粒上，协助解决氧化性损伤导致端粒延伸提前终止的问题[58]。因此，通过靶向PRDX1来抑制端粒酶延伸端粒，可为肿瘤治疗提供思路。由于OGG1 参与端粒DNA 氧化性损伤修复，靶向OGG1 的抑制剂可导致氧化性碱基的累积、端粒丢失、细胞增殖障碍等[59]。在降低OGG1 表达时，肿瘤生长受到抑制[60]。此外，研究发现在肝癌细胞中，NEIL3表达量升高，这与肝癌患者预后不良相关，NEIL3的表达量与肝癌患者整体生存率呈负相关。NEIL3 缺失时，细胞增殖变慢，DNA损伤增加，随后出现细胞衰老。NEIL3 在有丝分裂时期参与端粒DNA 氧化性损伤修复，通过招募AP 核酸酶进行BER 修复，实现对端粒的保护，从而阻止肝癌细胞的衰老[61]。细胞衰老是抗肿瘤的一种重要机制，化疗、放疗、CDK4/6抑制剂以及端粒酶抑制剂等方式可诱导肿瘤细胞衰老，限制细胞生长[62]。进一步开发靶向端粒DNA 修复机制的药物，引起肿瘤细胞衰老，这将为肿瘤治疗提供新靶点。

4 小结

端粒DNA 由于其特殊的结构，需要末端保护，避免DNA 损伤信号通路的激活以及端粒功能的紊乱。然而，当端粒DNA 内部发生损伤时，端粒可以通过相应的方式修复DNA 损伤。在正常细胞中，端粒若修复受阻，可能导致损伤积累以及基因组不稳定，细胞出现衰老。衰老的细胞会出现衰老相关的分泌表型，分泌多种炎症因子，影响组织微环境以及疾病的发生与发展。端粒DNA 损伤修复的研究可能为改善衰老以及衰老相关疾病提供重要依据。此外，在某些肿瘤细胞中，DNA损伤修复蛋白出现高表达，这些蛋白在端粒损伤修复中尤为重要，通过抑制剂引起细胞衰老，可特异靶向肿瘤治疗。研究端粒DNA 损伤修复的调控机制，可为肿瘤防治提供新的方向与应用前景。

（利益冲突：无）