Allo-PBSCT患者CD4+CD25+调节性T细胞的体外研究

翟海龙，赖永榕

(1黄石理工学院医学院，湖北 黄石 435003;2广西医科大学第一附属医院)

异基因外周血干细胞移植(Allo-PBSCT)是近年来临床上广泛采用的一种先进的造血干细胞移植技术，对白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤等恶性血液病有很好的治疗效果;然而，移植物抗宿主病(GVHD)作为Allo-PBSCT一种常见的严重的并发症长期困扰着临床。动物实验表明，Allo-PBSCT后 CD4+CD25+Tregs可抑制激活的T细胞而预防GVHD［1］。为此，本研究对Allo-PBSCT后CD4+CD25+Tregs体外是否有无反应性及其抑制功能进行了研究。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2004年10月～2006年5月在广西医科大学第一附属医院血液科行Allo-PBSCT的血液恶性肿瘤患者36例(Allo-PBSCT组)，男27例、女9例，年龄9～56岁、中位年龄34岁;其中，急性髓细胞白血病7例，急性淋巴细胞白血病9例，慢性粒细胞白血病14例，非霍奇金淋巴瘤1例，多发性骨髓瘤1例，骨髓增生异常综合征4例。36例中，GVHD患者16例(GVHD组)，无GVHD患者20例(无GVHD组)。供者均为同胞兄弟姐妹，HLA配型6个位点全相合44例，1个位点不相合3例。对照组募集健康志愿者7例，男5例、女2例，年龄24～34岁、中位年龄28岁。在移植后+30 d采集上述Allo-PBSCT组和对照组EDTA抗凝外周血20 ml。

1.2 方法

1.2.1 主要实验试剂、仪器 荧光单抗试剂:美国BD公司产;CD4+CD25+Tregs分离试剂盒:德国Miltenyi生物技术公司产;淋巴细胞分离液:上海检测试剂公司产;IL-2、IL-4、IL-10、TGF-β、IFN-γ ELISA检测试剂盒:晶美生物工程有限公司产。EPICS-XL流式细胞仪:美国Beckman Coulter公司产;Midi和Mini磁性细胞分离柱、磁性细胞分离器:均为德国Miltenyi生物技术公司产;精华牌TGL-16G型高速离心机:太仓市医疗机械厂产。MK3型酶标仪:美国Thermo电子公司产。

1.2.2 CD4+CD25+Tregs增殖和混合淋巴细胞反应 ①分离外周血单个核细胞(PBMCs)。②分离CD4+CD25+Tregs。③CD4+CD25+Tregs和 CD4+CD25-T细胞的记数和纯度检测:CD4+CD25+Tregs和CD4+CD25-T细胞记数前，可得到(1.0～1.1)×105个 CD4+CD25+Tregs和(1.2 ～1.5)×105个CD4+CD25-T细胞。取CD4+CD25+Tregs细胞液和CD4+CD25-T细胞各100 μl行流式细胞术检测，检测指标为CD4和CD25。如CD4+CD25+Tregs和CD4+CD25-T细胞的纯度均大于80%，即可从事下面的实验。④离体CD4+CD25+Tregs的增殖和混合淋巴细胞反应:a.细胞培养:分别取2×104CD4+CD25+Tregs和CD4+CD25-T细胞以及2×104个CD4+CD25+Tregs与2×104个CD4+CD25-T细胞混合3组细胞构成1个大组，建立2个大组;将这2个大组加入到96孔培养板的6个孔中，再加入RPMI1640细胞培养液 200 μl，10% 小牛血清，10 μg/ml可溶性抗 CD3-mAbs 试剂 2 μl，5 μg/ml抗CD28-mAbs试剂4 μl，置于37℃培养箱中培养72 h。b.检测细胞数量:取1个大组的3个孔每孔加入10 μl CCK-8溶液，将培养板置于37℃培养箱孵育1 h，取出后置于酶标仪上450 nm波长检测OD450值。c.显微摄影(×100)。

1.2.3 CD4+CD25+Tregs 离体分泌和抑制 CD4+CD25-T细胞分泌实验 细胞培养48 h后从培养箱中取出培养板，将3个孔的细胞液移至0.5 μl离心管中用高速离心机以5000 r/min离心10 min。吸取上清液于0.5 ml的离心管中，编号后将离心管置于-70℃的低温冰箱中，待积累到47例份后用双抗体夹心ELISA 法测其 IL-10、TGF-β、IFN-γ细胞因子的浓度。

1.3 统计学方法 运用SPSS11.5统计软件，计量资料采用表示，多个样本均数比较采用方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD4+CD25+Tregs和 CD4+CD25-T细胞的纯度 本实验中CD4+CD25+Tregs和CD4+CD25-T细胞的纯度均大于80%。

2.2 CD4+CD25+Tregs的无反应和抑制实验 有无GVHD患者和对照组CD4+CD25+Tregs OD450值极低，均与本组CD4+CD25-T细胞有统计学差异(P＜0.01)。表明有无 GVHD患者 CD4+CD25+Tregs在抗CD3-mAbs和抗CD28-mAbs的共同刺激下不增殖，表现出与正常对照组人群CD4+CD25+Tregs类似的无反应性特征。同样，有无GVHD患者混合细胞也有类似特征。见表1。

表1 CD4+CD25+Tregs的无反应和抑制实验(OD450值，)

表1 CD4+CD25+Tregs的无反应和抑制实验(OD450值，)

注:与本组CD4+CD25-T细胞比较，*P＜0.01

组别 n CD4+CD25+Tregs CD4+CD25-T细胞 混合细胞对照组 70.052 ±0.008* 1.780 ±0.5370.529 ±0.074*GVHD 组 160.048 ±0.009* 1.732 ±0.7410.607 ±0.058*无 GVHD 组 200.049 ±0.011* 1.695 ±0.6280.572 ±0.063*

2.3 CD4+CD25+Tregs离体分泌和抑制 CD4+CD25-T细胞分泌实验 有无GVHD患者离体CD4+CD25+Tregs在抗CD3-mAbs和抗CD28-mAbs的共同刺激下分泌的 IL-10、TGF-β和 IFN-γ低于CD4+CD25-T细胞(P＜0.01)，有无 GVHD 患者两细胞混合分泌的这3种细胞因子均低于CD4+CD25-T细胞(P＜0.05)。这些均与对照组类似。见表 2、3、4。

3 讨论

表2 各组CD4+CD25+Tregs离体分泌和抑制CD4+CD25－T细胞分泌 IL-10结果(mmol/L，)

表2 各组CD4+CD25+Tregs离体分泌和抑制CD4+CD25－T细胞分泌 IL-10结果(mmol/L，)

注:与同组CD4+CD25-T细胞比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

组别 n CD4+CD25+Tregs CD4+CD25-T细胞 混合细胞对照组 7 6.67 ±2.58＊＊ 35.71 ±5.28 22.57 ±4.82*GVHD 组 1611.52 ±4.89＊＊ 41.06 ±5.59 25.34 ±5.02*无 GVHD 组 2010.25 ±3.21＊＊ 38.65 ±4.39 26.37 ±4.52*

表3 各组CD4+CD25+Tregs离体分泌和抑制CD4+CD25－T 细胞分泌 TGF-β结果(mmol/L，)

表3 各组CD4+CD25+Tregs离体分泌和抑制CD4+CD25－T 细胞分泌 TGF-β结果(mmol/L，)

注:与同组CD4+CD25-T细胞比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

组别 n CD4+CD25+Tregs CD4+CD25-T细胞 混合细胞对照组 74.87 ±2.52＊＊ 14.27 ±2.35 8.32 ±3.58*GVHD 组 165.23 ±2.91＊＊ 18.27 ±3.72 11.69 ±4.57*无 GVHD 组 205.09 ±2.83＊＊ 16.49 ±3.81 10.63 ±3.59*

表4 CD4+CD25+Tregs离体分泌和抑制CD4+CD25－T 细胞分泌 IFN-γ结果(mmol/L，)

表4 CD4+CD25+Tregs离体分泌和抑制CD4+CD25－T 细胞分泌 IFN-γ结果(mmol/L，)

注:与同组CD4+CD25-T细胞比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

组别 n CD4+CD25+Tregs CD4+CD25-T细胞 混合细胞对照组 7 7.68 ±3.26＊＊ 46.72 ±6.23 25.73 ±5.66*GVHD 组 16 9.43 ±3.18＊＊ 52.46 ±8.59 26.54 ±6.78*无 GVHD 组 2012.45 ±4.16＊＊ 61.26 ±7.48 34.86 ±5.75*

CD4+CD25+Tregs功能特征性标志为无反应性和抑制功能［2］，即 CD4+CD25+Tregs在体外对TCR激活或促有丝分裂抗体刺激下不增殖;而且在与CD4+CD25-T细胞的混合培养中，可以抑制后者产生IL-2基因的转录，可以抑制后者的增殖和分泌细胞因子。CD4+CD25+Tregs需通过其TCR被激活，一旦激活，其抑制功能是非特异性的［3］。CD4+CD25+Tregs还可把其抑制功能传染给传统的CD4+T细胞，成为传染性耐受，这种传染性耐受是细胞接触依赖性，由 TGF-β 部分调节［4］。

为了检测Allo-PBSCT受者外周血CD4+CD25+Tregs的体外功能，我们做了离体CD4+CD25+Tregs的无反应性和抑制实验。我们发现有无GVHD移植受者的外周血CD4+CD25+体外在可溶性抗CD3-mAbs和抗CD28-mAbs的刺激下，均不增殖，表现出其无反应性。而且在与CD4+CD25-T细胞的混合培养中均可抑制CD4+CD25-T细胞的增殖和分泌细胞因子，表现出其抑制功能。这些均与正常对照组外周血CD4+CD25+Tregs的功能类似，与Beyer等［5］的研究结果相同。说明有无GVHD移植受者的外周血CD4+CD25+Tregs仍保持了正常CD4+CD25+Tregs的功能，是真正的免疫调节性T细胞。

本研究中，由于造血干细胞在受者骨髓植活，受者造血功能恢复，故CD4+CD25+Treg极有可能在受者骨髓中大量产生。其来源可能有二:一是供者的Tregs增殖，二是供者来源的非 Tregs转化而来［6］。这些CD4+CD25+Treg保持正常免疫调节功能就可以抑制移植物中激活的T细胞，避免其对受者组织的攻击，从而预防GVHD的发生。

总之，本实验发现 Allo-PBSCT受者外周血CD4+CD25+Tregs具有与健康人CD4+CD25+Tregs类似的无反应性和抑制能力，说明有无GVHD移植受者的外周血CD4+CD25+Tregs仍保持了正常CD4+CD25+Tregs的体外功能，是真正的免疫调节性T细胞。如果能有效地利用Allo-PBSCT受者外周血CD4+CD25+Tregs的抑制功能，则有可能降低Allo-PBSCT后GVHD的发病率。

［1］Adeegbe D，Bayer AL，Levy RB，et al.Cutting edge:allogeneic CD4+CD25+FOXP3+T regulatory cells suppress autoimmunity while establishing transplantation tolerance［J］.J Immunol，2006，176(12):7149-7153.

［2］Takahashi T，Tagami T，Yamazaki S，et al.Immunologic self-tolerance maintained by CD4+CD25+regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4［J］.J Exp Med，2000，192(2):303-310.

［3］Thornton AM，Shevach EM.Suppressor effector function of CD4+CD25+immunoregulatory T cells is antigen nonspecific［J］.J Immunol，2000，164(1):183-190.

［4］Jonuleit H，Schmitt.The regulatory T family:distinct subsets and their interrelations［J］.J Immunol.，2003，171(12):6323-6327.

［5］Beyer M，Kochanek M，Giese T，et al.In vivo peripheral expansion of naive CD4+CD25 high FOXP3+regulatory T cells in patients with multiple myeloma［J］.Blood，2006，107(10):3940-3949.

［6］Mielke S，Rezvani K，Savani BN，et al.Reconstitution of FOXP3+regulatory T cells(Tregs)after CD25-depleted allotransplantation in elderly patients and association with acute graft-versus-host disease［J］.Blood，2007，110(5):1689-1697.