灵猫方药物血清体外抗乙肝病毒作用的研究*

朱晓骏 孙学华 李 璐 高月求

上海中医药大学附属曙光医院肝病科 (上海，200021)

灵猫方是本院肝病科治疗慢性乙型肝炎 (CHB)的常用方剂，本文拟采用血清药理学的研究方法［1］来验证其体外抑制乙肝病毒 (HBV)的效果。

1 材料与方法

1.1 动物与细胞株 SD雄性大鼠15只，体重250～300g，由上海中医药大学实验动物中心提供。HepG 2.2.15细胞，由上海公共卫生中心惠赠。

1.2 主要药品 灵猫方中药颗粒剂由江阴天江制药有限公司提供，批号：0912302，醋青皮1.5g(相当于生药9g)，黄芪2.25g(相当于生药15g)，胡黄连1.5g(相当于生药9g)，猫爪草1.5g(相当于生药15g)，仙灵脾0.75g(相当于生药15g)，女贞子1.5g(相当于生药15g)。

1.3 主要试剂与仪器 DMEM细胞培养液：DMEM培养基(GIBCO进口分装);0.25%胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶0.25g(Difeo进口分装);小牛血清：杭州四季青生物公司生产;SpectraMax M5多功能酶标仪：美国Molecular Devices产品。

1.4 灵猫方含药血清的制备 将15只成年大鼠，按照随机数字表法，平均分为3组，每组5只，分别为10倍灵猫方组(简称10倍组)，5倍灵猫方组 (简称5倍组)，生理盐水组(简称盐水组)。大鼠给药量按照10倍、5倍成人标准体重(50Kg为标准体重)计算。灵猫方颗粒剂给药剂量：10倍灵猫方组为0.18g·100g-1d-1，5倍灵猫方组为0.09g·100g-1d-1。各组动物在同等条件下饲养，生理盐水组及中药组大鼠每日早晚各1次空腹灌胃，连续3天，末次给药1小时后空腹苯巴比妥麻醉，腹主动脉采血，在无菌条件下静置2小时以上，3 000rpm离心10～15分钟分离血清，56℃水浴箱内放置30分钟，应用0.22μm微孔膜过滤除菌，分装，置于 -80℃冰箱保存备用。

1.5HepG2.2.15细胞的培养及检测 处于对数生长期的HepG 2.2.15细胞用0.25%胰蛋白酶消化成单个细胞，接种于96孔培养板(2.0 ×104细胞/孔)，分别加入培养液100μl/每孔。在5%CO2细胞培养箱培养24小时后换入含药培养液 (含药血清用培养液按1∶10稀释加入培养孔)，每72小时更换新鲜含药培养液，共3次，换出的细胞上清液用于检测HBsAg、HBeAg(酶联免疫法)。具体操作如下：①每孔加入待测样品50μl，设阴、阳性对照各两孔，每孔加入阴性对照 (或阳性对照)各50μl，并设空白对照1孔;②每孔加入酶结合物50μl(空白对照孔除外)，充分混匀，封板，置37℃孵育30分钟;③弃去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置5秒，甩干，重复5次后拍干;④每孔加显色剂A液、显色剂B液各50μl，充分混匀，封板，置37℃孵育15分钟;⑤每孔加入终止液50μl，混匀;⑥用酶标仪读数，取波长450nm，参考波长630nm，先用空白孔校零，然后读取各孔OD值。

1.6 统计学方法 对HBsAg和HBeAg抑制率按下列公式计算：抑制率=(生理盐水组OD值 -含药血清组OD值)×100%/生理盐水组OD值。OD值用均数±标准差表示，用SPSS 10.0统计软件进行数据分析，3组均数比较采用ANOVA方差分析，P≤0.05认为有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组血清对HepG 2.2.15细胞上清液中 HBsAg的抑制作用 见表1。分析不同时间点含药血清对HepG 2.2.15细胞上清液中的HBsAg抑制率，显示第6天达到最高峰，此后下降。

2.2 3 组血清对HepG 2.2.15细胞上清液中HBeAg的抑制作用 见表2。分析不同时间点含药血清对HepG 2.2.15细胞上清液中的HBeAg抑制率，显示第6天达到最高峰，此后下降。

3 讨论

在我国一般人群的HBsAg阳性率为7.18% ，接种与未接种乙型肝炎疫苗人群的 HBsAg阳性率分别为 4.51% 和9.51%［2］。CHB 5年发生肝硬化的几率是8% ～20%，发生肝硬化后5年内发生失代偿的几率是20%，代偿期的肝硬化5年生存率是80%～86%，失代偿期患者的5年生存率是14%～35%，每年在肝硬化基础上发生肝细胞癌是2% ～5%［3］。目前对CHB的治疗，主要是选用干扰素和核苷酸类似物，这些药物对病毒有良好地抑制作用，但存在副作用大、病毒变异，停药后容易复发等缺点。而采用中药可通过免疫调节、抗炎、抗病毒等多方面起作用。

中药复方不能直接用于培养细胞，通过药物血清验证其对HBsAg、HBeAg的作用，是目前一种简单可行的方法。HepG 2.2.15细胞是HepG2细胞转染HBV 全基因序列［4］，因能够稳定分泌HBV而广泛应用于体外研究。灵猫方是在补肾法治疗CHB的基础之上，结合临床经验所创立的，我们发现单纯应用清热化湿的方法，治疗CHB的效果并不佳，在清热化湿的同时应用补肾法则往往能提高疗效。灵猫方具有补肾和清热化湿的作用。本实验证明灵猫方药物血清能够抑制HBV，值得进一步研究。

［1］方肇勤主编.实验中医学［M］.第3版，上海：上海科学技术出版社，2008：212-213.

［2］梁晓峰，陈园生，王晓军，等.中国3岁以上人群乙型肝炎血清流行病学研究［J］.中华流行病学杂志，2005，26(9)：655-658.

［3］EASL.Clinical Practice Guidelines：Management of chronic hepatitis B［J］.Hepatology ，2009，50(2)：227-242.

［4］SELLS MA，CHEN ML，ACS G.Production of hepatitis B virus particles in HepG cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA［J］.PNAS，1987，84(4)：1005-1009.

表13 组血清对HepG 2.2.15细胞HBsAg抑制作用比较(±s)

表13 组血清对HepG 2.2.15细胞HBsAg抑制作用比较(±s)

与生理盐水组比较，*P＜0.001;与5倍药物血清组比较，△P＞0.05

组别 n 第3d OD值 抑制率 (%)第6d OD值 抑制率 (%)第9d OD值 抑制率 (%)盐水组3 1.754 ±0.012 2.876 ±0.011 3.288 ±0.010 5 倍组 3 1.277 ±0.008* 27.2 1.156 ±0.011* 59.8 1.986 ±0.011* 39.6 10倍组 3 1.262 ±0.011＊△ 28.0 1.146±0.012＊△ 60.1 1.977±0.011＊△39.9

表23 组血清对HepG 2.2.15细胞HBeAg抑制作用比较(±s)

表23 组血清对HepG 2.2.15细胞HBeAg抑制作用比较(±s)

与生理盐水组比较，＊＊P＜0.01;与5倍药物血清组比较，△P＞0.05

组别 n 第3d OD值 抑制率 (%)第6d OD值 抑制率 (%)第9d OD值 抑制率 (%)盐水组3 1.584 ±0.013 2.785 ±0.011 3.326 ±0.009 5倍组 3 1.019 ±0.008＊＊ 35.7 1.026±0.013＊＊ 63.1 1.889±0.010＊＊ 43.2 10倍组 3 1.012±0.010＊＊△ 36.1 1.014±0.0110＊＊△ 66.1 1.8776±0.0094＊＊△43.6