髓系细胞触发受体-1在非酒精性脂肪性肝炎中的作用*

张丽霞 刘近春 武 雯 李俊华 秦 涛

1.天津市公安医院内二科 (天津，300060) 2.山西医科大学第一临床医学院消化内科

非酒精性脂肪性肝病 (NAFLD)是一种与胰岛素抵抗(IR)和遗传易感性密切相关的代谢应激性肝损伤。随着肥胖和糖尿病患者的增多，NAFLD已成为西方发达国家慢性肝病的首要病因，并呈现出全球化发病的趋势，在我国其亦发展成为仅次于慢性病毒性肝炎的第二大肝病。其中非酒精性脂肪性肝炎 (NASH)不仅仅已成为继丙型肝炎、原发性胆汁性肝硬化之后隐源性肝硬化的重要原因之一，甚至是公认的可以发展为肝纤维化和肝硬化甚至肝癌的一个病因。本研究观察了NASH模型4周、8周大鼠血浆中 (TREM-1)水平的变化及其肝脏的病理学改变，旨在阐明TREM-1在NASH发生发展中起着重要的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠24只 (由山西医科大学实验动物中心提供)，体重150～180ɡ。猪油自备;胆固醇 (南京建成生物工程研究所);鲎试剂定量检测试剂盒 (厦门市鲎试剂实验厂有限公司);ALT、AST试剂盒 (南京建成生物工程研究所);TNF-α试剂盒 (解放军总医院科技开发中心放免所);IL-6、IL-10试剂盒 (上海森雄科技实业有限公司);TREM-1 ELISA试剂盒 (上海麦莎生物科技有限公司);Hovapath TM型酶标仪：BIO-RAD;Mistral 2000R低温超速离心机：日本SANYO公司;UV-2102C型分光光度计：尤尼柯 (上海)仪器有限公司;OLYMPUSBH-2显微照相系统：日本奥林巴斯光学工业株式会社。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的制作 参考邢凌翔非酒精性脂肪性肝炎模型的建立［1］，SD大鼠适应性喂养1周后，随机分为两组：对照组、模型组，每组12只。

1.2.2 动物处理 于实验第 4周、8周末，禁食过夜，次日称量体重后以1.0%戊巴比妥钠 (3.0ml/100g体重，ip)麻醉，手术开腹，在无菌无热原条件下，分别从腹主动脉、门静脉采血5.0ml，离心4000转/分，15分钟，吸取上清液置 -70℃保存，待测 TNF-α、AST、ALT、IL-6、IL-10、TREM-1及ET等;分离肝脏之后迅速从肝右叶中部切取1小块肝组织置于-70℃冷冻保存备用，用ELISA方法检测肝脏TREM-1;取部分肝右叶放于10%中性甲醛液中固定，石蜡包埋，4μm切片，作HE染色后，在显微镜下观察肝脏组织学变化情况。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行数据分析，实验数据结果采用均数±标准差表示，进行单因素ANOVA(方差分析)，相关性研究采用Pearson相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠肝脏TREM-1含量的变化 见表1。

2.2 两组大鼠血浆ALT、AST、TNF-α、ET、IL-6、IL-10含量的变化 见表2。

2.3 肝脏病理组织学改变 肉眼观察，正常大鼠肝脏外观呈红褐色，有光泽，质地柔软而富有弹性，被膜光滑，边缘锐利，切面光洁;光镜下可见正常对照组大鼠肝组织结构完整，肝小叶结构正常，肝细胞索排列整齐，肝窦正常，肝细胞无明显病变，核大圆居中，肝窦排列规则。模型组大鼠肝脏较正常组色泽暗淡，可见局部黄白色的变性灶，质地较硬，体积明显增大，包膜紧张，边缘圆钝，切面油腻。光镜下所有模型组动物均出现程度不同的弥漫性肝细胞脂肪变性，主要为小泡性脂肪变性。模型组所有标本小叶内均可见炎症细胞浸润或散在的点状或融合坏死，病变程度随时间延长而加重。

表1 4周、8周时各组大鼠肝脏TREM-1含量的变化

2.4 直线相关性分析 肝脏TREM-1和 TNF-α、IL-6、ET呈正相关 (r值分别为 0.83，0.85，0.76，P ＜ 0.01); 与 IL-10负相关 (r值为 -0.83，P ＜0.01)。

3 讨论

从2000年国外研究人员［2］发现TREM以来，TREM受到越来越多的关注。TREM是一种新型的免疫球蛋白超家族炎症触发受体。人类TREM至少包括TREM-1和TREM-2这两个激活受体和一个抑制受体TLT-1。而在小鼠体内除了TREM-1和TREM-2外，还存在TREM-3。

TREM-1是TREM家族中较早被发现并被研究的一员，由于其在机体炎症反应中起到相当重要的作用而一直受到广泛的关注。科学家通过克隆TREM-1cDNA全长发现，这种选择性的表达于血液中的中性粒细胞和单核/巨噬细胞表面的模式识别受体是一种跨膜蛋白，它的胞外区由一个V型结构域构成，胞浆区很短，仅有5个氨基酸组成，跨膜区包括一个带正电荷的赖氨酸残基［2］。新近研究发现TREM-1配体可能位于血小板表面，且与白细胞活性相关［3］。TREM-1的表达主要受细菌、真菌及细菌代谢产物脂多糖 (Lipopolysaccharide，LPS)的调节。TREM-1在LPS等刺激下表达水平不仅升高而且有促进炎性因子分泌的作用［2，4］，其与配体结合后能诱导中性粒细胞和单核细胞分泌TNF-α、IL-1β、INF-γ等炎症因子以及中性粒细胞趋化因子IL-8、单核细胞趋化性蛋白 (MCP-1、MCP-3和巨噬细胞炎症反应蛋白MIP-1α;活化单核细胞表面CD40、CD86和CD54等共同刺激分子，还能诱导中性粒细胞释放髓过氧化物酶［2］和磷脂酶C酪氨酸磷酸化;可以使中性粒细胞迅速脱颗粒、呼吸爆发及吞噬作用，并能中和Toll样受体激活后介导的抗细胞凋亡作用［5］，从而导致“过度”炎症反应，最终可引起炎症反应的增强、放大。

表24 周、8周时各组大鼠血浆ALT、AST、TNF-α、ET、IL-6、IL-10检测值比较(±s)

表24 周、8周时各组大鼠血浆ALT、AST、TNF-α、ET、IL-6、IL-10检测值比较(±s)

与同期对照组比较，*P＜0.05

时间 组别 ALT(IU/L) AST(IU/L) TNF-α(ng/ml) ET(EU/L) IL-6(pg/ml) IL-10(pg/ml)4 周 对照组 (n=6) 73.05 ±5.09 31.13 ±1.24 1.11 ±0.03 0.04 ±0.01 27.96 ±5.81 32.71 ±2.34模型组 (n=6) 89.42 ±18.31* 50.99 ±6.73* 1.99 ±0.02* 0.06 ±0.01* 33.53 ±3.60 13.14 ±4.29*8 周 对照组 (n=6) 73.88 ±4.78 33.97 ±4.43 1.12 ±0.04 0.04 ±0.01 28.80 ±1.29 32.87 ±2.11模型组 (n=6) 92.86 ±1.51* 79.93 ±13.35* 2.08 ±0.03* 0.07 ±0.01* 38.51 ±5.33* 13.12 ±1.74*

在正常组织中，TREM-1选择性的表达于肺泡巨噬细胞表面，从而可以清除病原体、凋亡细胞和大分子物质［6］。而且在浸润的中性粒细胞以及被感染的皮肤上皮细胞和被革兰氏阴性菌、阳性菌或真菌感染的淋巴结中，TREM-1也均呈现出高表达现象［7］，TREM-1这种在细胞和组织中的分布特点提示它可能参与了炎症反应。之后的相关研究表明与健康人群相比，急性胰腺炎患者体内TREM-1mRNA表达量不仅明显增加，而且在炎症的不同阶段其表达量亦明显不同，提示TREM-1与炎症程度密切相关［8］;Detemann 等［9］人对细菌性脑膜炎患者进行回顾性研究发现患者体内TREM-1表达被上调，阻断TREM-1可以消除LPS所引起的感染性休克［10］;急性内毒素血症时，肝巨噬细胞和内皮细胞也表现出TREM-1高表达的现象［11］，故TREM-1最初被认为仅在急性炎症时发挥作用，并且此观点得到了普遍的认可［7］。正常肠道单核巨噬细胞无TREM-1的表达，从而防止了肠道内微生物引起的过度炎症反应［12］，而Mirjam等［13］人经动物和临床实验却发现在慢性炎症性肠疾病中TREM-1不仅呈现出高表达现象，而且和疾病的活动性密切相关。后研究表明在肝脏慢性肉芽肿性炎、消化性溃疡病及溃疡性结肠炎和Crohn病等慢性炎症疾病中 TREM-1的表达均表现为高水平状态［13～15］，说明TREM-1不仅参与急性炎症反应而且在慢性炎症性疾病中也有着不可忽略的作用。

本实验鉴于上述思路设计了此次研究，在研究所得结果中发现与对照组相比较，模型组大鼠TREM-1在4周时表达量即已明显增高，8周时更加明显，而且模型组TNF-α、IL-6、内毒素 (ET)均明显升高，IL-10表达量却下降，说明在此次的NASH模型中伴有肠源性内毒素血症 (IETM)的形成。相关分析显示，TREM-1与ET、TNF-α、IL-6均呈正相关，而与IL-10呈负相关，提示TREM-1不仅可能通过诱导TNF-α、IL-6等炎症因子的高表达以及IL-10的低表达而参与NASH的发展，而且通过IETM可能也参与了NASH的发生以及对肝脏的损害，其机制可能是：IETM时，LPS经Toll样受体4(toll like receptor 4，TLR-4)识别后，通过TLR-4介导的信号转导途径激活了NF-κB，促炎因子TNF-α、IL-6表达上调而抗炎因子IL-10表达下调，促炎介质与抗炎介质处于失平衡状态，无法正常维持机体内环境稳态，使得肝细胞受损，转氨酶ALT、AST表达升高。同时受LPS调节呈现高表达的TREM-1与接头蛋白DAP-12偶联后［16］，通过其介导的酪氨酸磷酸化、丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK)的激活等将转录复合物激活，协同NF-κB促进炎症因子基因的转录，使得单核细胞分泌大量TNF-α、IL-6等促炎因子，而抗炎因子IL-10受抑制呈现低水平表达，进而促进了促炎介质与抗炎介质之间的不平衡，加重了肝脏的损害。这样在众多细胞因子的共同作用下导致了肝细胞受损，在此过程中TREM-1与TLR-4通过协同作用共同介导了炎症反应，其中TREM-1主要是扩大由TLR-4启动的炎症反应。

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