姜黄素对小鼠非酒精性脂肪性肝炎炎症信号传导通路的调控作用*

诸葛丽 苏冬梅 李 健 杨美娟 刘云霞 李军祥△

1.北京中医药大学东方医院消化内科 (北京，100078) 2.北京中医药大学基础医学院人体形态学系

NASH是非酒精性单纯性脂肪肝 (NAFL)向非酒精性脂肪性肝硬化 (NAC)进展过程中的重要环节，是隐源性肝硬化的重要原因之一［1］。NASH发病机制不明确，目前国际上公认的为“二次打击学说”。在NASH发病的“第二次打击”中，NF-κB促炎信号传导通路及PPARr抗炎信号传导通路的失衡是导致脂肪性炎症发生和发展的重要原因之一［2］。姜黄素是一种多酚类化合物，主要存在于姜科及天南星科植物的根茎中。它是我国常用中药姜黄、郁金、莪术、石菖蒲中的主要有效化学成分。研究表明姜黄素可抑制多种原因诱发的肝脏疾病［3］，具有抗纤维化，抗炎以及线粒体保护等作用。目前针对姜黄素干预NASH的研究较少，且主要集中在疗效方面，并没有进一步探讨其作用机制。本文通过建立MCD饮食诱导的小鼠NASH模型，研究并探讨中药单体姜黄素对NASH的炎症信号传导通路的调控作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本实验选用8～12周龄C57/BL6雄性♂小鼠，体重20±2g，(北京维通利华实验动物技术有限公司提供)。实验动物常规饲养于北京中医药大学清洁级动物房，12小时光照和黑夜循环，温度 (22±2)℃，湿度50% ～60%。

1.2 实验用饲料、药物、主要试剂及仪器 MCD饲料的配方参考国外文献［4］。MCS饲料配方［5］，即MCD对照饲料，是在MCD饲料配方基础上，加上胆碱2g/Kg、蛋氨酸3g/Kg。MCD及MCS饲料均由江苏南通特洛菲饲料有限公司加工制作，为清洁级饲料，4℃低温保存。姜黄素由西安冠宇生物技术有限公司提供，98%标准品。姜黄素灌胃用药剂量按实验动物与人体体表面积比等效量核算比率，计算出小鼠的等效剂量为1.15g/kg，溶剂选用DMSO。油红O及HE染色相关试剂购自美国Sigma公司;ALT、AST试剂盒购自于中生北控科技股份有限公司;TNF-α、IL-4、IL-6试剂盒购自于北京华英生物技术研究所;PPARγ抗体及 NF-κB抗体购自于 abcam公司。

1.3 模型制备及分组 15只C57/BL6雄性小鼠予普通饲料适应性饲养1周后随机分成3组，予以造模及药物干预。MCS组5只 (即空白对照组)，予以MCS饲料喂养;MCD组5只(即模型组)，予以MCD饲料喂养;姜黄素组5只 (姜黄素干预组)，予以MCD饲料喂养;实验动物自由摄食、饮水。

1.4 药物干预及取材 造模即日起，姜黄素组予以姜黄素溶液0.1ml/10g灌胃，1次/d，选用DMSO作为溶剂;MCS组和MCD组均予以DMSO，0.1ml/10g灌胃，1次/d，连续两周。姜黄素灌胃用药剂量按实验动物与人体体表面积比等效量核算比率，计算出小鼠的等效剂量为1.15g/kg。两周药物干预实验结束，小鼠禁食水12小时后，称重;乙醚麻醉;眼静脉取血，分离血清，-80℃保存;肝脏称重后部分液氮冻存，部分4%多聚甲醛固定。

1.5 指标检测

1.5.1 肝组织病理学检测 小鼠肝组织冰冻切片，行常规油红O染色;肝组织石蜡切片，行常规HE染色。油红O及HE切片光镜下评估肝脏脂肪变性和炎症活动情况。NASH的病理诊断标准采用“亚太地区非酒精性脂肪性肝病诊断与治疗共识”推荐的美国国立卫生研究院NASH临床研究网络病理委员会2005年所定指南，根据其制定的NAFLD活动度积分(NAFLD Activity Score，NAS)进行评估。NAS组织学评分系统对14项病理改变，3项指标进行了半定量评估计分：肝脂肪变 (按发生脂肪变性实质细胞/总细胞数，＜5%、5% ～33%、33% ～66%、＞66%，分别计0～3分)、小叶内炎症(按无病灶、＜2、2～4、＞4，分别计0～3分)、肝细胞气球样变 (按无、少量气球样细胞、较多/显著气球样变，分别计0～2分)，其中NAS≥5分者可明确NASH的诊断，NAS＜3分则可排除NASH，两者之间者为NASH可能。油红O及HE切片使用Olympus摄像系统进行观察和摄片。

1.5.2 血清生化指标检测 按照试剂盒提供说明书操作，血清ALT、AST采用全自动生化分析仪进行测定。

1.5.3 血清放射免疫 (Radioimmunoassay，RIA) 检测 按照试剂盒提供说明书测定血清中TNF-α、IL-4、IL-6水平。

1.5.4 Western blot检测 肝组织NF-κB、PPARγ 蛋白表达进行了Western blot检测：肝组织剪碎，置于匀浆器中，按10μl的裂解液/mg组织块的比例加入单去污剂缓冲裂解液，在匀浆器中进行匀浆，裂解30分钟后，将裂解液移至1.5ml离心管中，4℃，12000rpm离心5分钟。取上清置于-20℃保存。配置BSA标准液，混匀后室温放置两分钟，在分光光度计上比色分析，检测样品蛋白含量。配置凝胶，上样，电泳。进行蛋白质的电转移与膜的封闭，将滤纸和滤膜在转移缓冲液中浸泡15分钟，将滤膜放在平皿中，用1×丽春红溶液于脱色摇床上轻摇，染膜5分钟左右，然后用双蒸水洗，将滤膜放在平皿中，封闭液室温震摇1～2小时或4℃过夜。封闭结束后，将膜放入一塑料带中，加入溶有一抗的新鲜配制的封闭液;4℃轻轻振摇两小时，用封闭液清洗3次，每次10～15分钟，以除去过量的一抗;将膜转入另一塑料袋中，加入溶于封闭液的二抗;封口后室温振摇孵育1～2小时;取出滤膜，用TBST漂洗3～5次，每次10～15分钟，除去未结合的二抗。进行显色反应，凝胶图像分析。

1.6 统计学方法 所有数据均采用mean±SD表示 ，采用SPSS 17.0软件进行统计，显著性检测采用One-way ANOVA，对肝脏的病理学检查结果采用等级资料的秩和检测。统计学显著性用双侧检验P＜0.05。

2 结果

2.1 肝脏外观 MCS组小鼠肝脏外观无肿胀增大，呈深红色，有光泽，质软富有弹性，边缘锐利，密度正常 (见插页图1A)。MCD组小鼠肝脏体积增大，质量增加，呈黄色，薄膜紧张，边缘钝，弹性差，可见黄色脂肪斑，密度降低 (见插页图1 B)。姜黄素组小鼠肝脏体积及质量较MCS组无明显增加，呈淡红色，可见组织间充盈淡黄色脂肪斑点，边缘较钝，弹性减弱。(见插页图1C)。

2.2 肝组织病理检测结果 HE染色结果显示：MCS组小鼠肝组织肝窦清晰可见，肝索排列整齐，形态结构均正常 (见插页图2A);MCD组小鼠肝组织肝充满大量大小不一的脂肪空泡，肝细胞结构紊乱呈气球样变，炎性细胞浸润明显，呈灶状分布，其中肝细胞损害主要集中在腺泡1区，炎性细胞以单核细胞、淋巴细胞为主 (见插页图2B);姜黄素组小鼠肝组织可见少量脂肪空泡，较MCD组比较明显减少，少部分区域出现肝索结构紊乱，偶见炎性细胞浸润 (见插页图2C)。油红O染色结果显示：MCS组小鼠肝组织未见红色脂滴 (见插页图2A);MCD组小鼠肝组织可见大量红色脂滴，部分融合成片，表现为脂滴弥漫浸润入肝细胞中，肝小叶内含脂滴细胞数/总细胞数约为20% ～45%(见插页图2B);姜黄素组小鼠肝组织可见局部散在红色脂滴，成小颗粒状，肝小叶内寒脂滴细胞数/总细胞数约为0.05% ～7%(见插页图2C)。

肝组织病理评分如图3所示，MCD组肝组织NAS评分较MCS组显著升高 (P=0.000)，总分＞5分，符合NASH组织学诊断，模型复制成功。姜黄素组NAS评分较MCS组升高(P=0.018)，与MCD组相比显著下降，差异具有显著性意义(P=0.000)。

图3 各组小鼠肝组织H＆E和油红O染色及病理评分

2.3 血清AST、ALT指标检测结果 见表1。如表1所示，与MCS组相比，MCD组血清ALT(P=0.000)与AST(P=0.000)活性显著增加;黄姜素组与MCS组比较，血清ALT(P=0.002)与AST(P=0.001)升高;黄姜素组血清 ALT水平较MCD组显著下降 (P=0.000)，但与AST两组间差异无显著性意义。

表1 各组小鼠血清ALT与AST的检测结果比较 (mean±SD，U/L)

2.4 血清TNF-α、IL-6、IL-4检测结果比较 见表2。

表2 各组小鼠血清TNF-α水平检测结果比较 (mean±SD)

如表2所示，MCD组血清TNF-α水平较MCS组升高 (P=0.000);姜黄素组血清TNF-α水平较MCD组明显下降 (P=0.000)，且与MCS组差异无显著性意义。MCD组血清IL-6水平较MCS组升高 (P=0.036);姜黄素组血清IL-6水平较MCD组显著下降 (P=0.000)，且较MCS组有所下降 (P=0.028)。血清IL-4水平，3组之间差异无显著性意义。

2.5 Western blot实验结果

2.5.1 NF-κB 实验结果 见图 4。

图4 各组小鼠肝组织NF-κB的表达

如图4所示，MCD组小鼠肝组织NF-κB表达较MCS组明显升高 (P=0.034)。姜黄素组NF-κB表达较MCD组显著降低 (P=0.029)。

2.5.2 PPAR 检测结果 见图5。

图5 各组小鼠肝组织的PPARγ表达

如图5所示，MCD组小鼠肝组织PPARγ表达较MCS组显著降低 (P=0.001)。姜黄素组PPARγ表达较MCS组显著降低 (P=0.005)，与MCD组比较表达有所升高，但差异无显著性意义。

3 讨论

为了更明确的针对NASH进行研究，我们选用了MCD饮食诱导的动物模型，该模型是国际上公认的用于研究非酒精性脂肪性肝病 (NAFLD)中炎症及纤维化的最好动物模型之一［6］。本研究前期试验针对该模型进行了动态监测，结果显示MCD饮食诱导的NASH小鼠模型重复率高，造模2～3周时模型稳定性最好［7］。本研究中动物模型肝脏外观、病理评分、及血清ALT指标数据说明本研究成功复制了MCD饮食诱导的小鼠NASH模型。

本研究数据表明，经两周的干预性给药，姜黄素可降低小鼠血清ALT、TNF-α、IL-6水平，明显改善肝组织炎症病理，在干预NASH中起到一定的抗炎作用。针对NASH相关的炎症信号传导通路，我们进行了进一步的研究。

NF-κB是一种具有多项转录调节作用的蛋白质，在炎症和免疫反应中起枢纽作用［8］。NF-κB在肝组织的炎性反应、氧化应激、肝细胞凋亡和再生中发挥重要作用［9］。NF-κB具有p50和p65两个亚基，在静息细胞中，NF-κB与抑制蛋白单体IκBα和IκBβ以无活性结合形式存于细胞质。NF-κB活化后可诱导其他炎症介质基因表达，增强TNF-α、IL-lβ等细胞因子的基因转录，使其产生和释放增多，相关细胞因子继而再次激活 NF-κB，导致最初的炎症信号进一步放大［10］。NF-κB在MCD饮食诱导的动物模型早期即可被激活，在该模型中发挥关键的促炎作用，促使模型向NASH发展［11］。

PPARγ作为一种核转录因子，能与其特异性配体结合，进而在转录水平上调控多种基因表达，参与脂肪细胞分化、糖脂代谢、炎症与免疫等多种生理性效应。有研究表明，PPARγ在脂肪性肝炎中起重要的内源性调节作用，其可以降低促炎因子TNF-α、IL-6的生成。PPARγ基因缺失的小鼠喂食MCD饲料，与正常小鼠比较，发展成更严重的脂肪性肝炎［12］。PPARγ与配体结合并使之激活后，与视黄醛X受体α(retinoid X receptor α，RXRα)形成异二聚体，再结合于特异性DNA序列而使靶基因活化，此序列称为PPAR特异性反应元件 (peroxisome proliferator responsive element，PPRE)［13］。PPRE与NF-κB在脂肪肝和正常肝组织中作用相反，活性表现出抗炎机制，抑制脂肪肝炎症的发展。PPARγ的抗炎信号途径和 NF-κB的促炎信号途径失衡可能导致脂肪肝炎症的增加［2］。

本研究western blot试验显示，姜黄素可以抑制NF-κB的表达，而对PPARγ表达无明显作用。由此我们可以得出结论，在NASH的炎症信号传导通路中，姜黄素单向作用于NF-κB的促炎信号传导途径，抑制NF-κB的表达，从而减少炎症因子生成达到干预NASH的作用。而姜黄素对PPARγ的抗炎信号传导途径作用不明显。姜黄素在NF-κB的信号传导途径中的具体作用靶点是我们下一步深入研究的重点。

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