甲胎蛋白表达缺失的人肝癌HepG2细胞株的构建*

冉 云 邓 欣 杨大国 吴其恺 刘成海 陶艳艳 聂 广

1.湖北中医药大学2010级博士班 (湖北 武汉，430065) 2.深圳市第三人民医院 3.上海中医药大学肝病研究所

人肝癌HepG2细胞株能够稳定高表达甲胎蛋白(AFP)［1］，AFP作为肿瘤标志物，在肝癌的发生发展中发挥重要作用。为进一步探讨AFP的作用机制，我们采用RNAi技术构建不表达或少表达AFP的HepG2模型细胞株。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 SiRNA由英俊公司合成，pll 3.7载体由上海比昂生物医药科技有限公司提供，Agarose Gel DNA Purification Kit Ver2.0(TaKaRa)购自大连宝生物公司，293T细胞株购自中科院上海细胞所，DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶、限制性内切酶均购自Invitrogen公司，T4 DNA连接酶购自NEB公司，质粒DNA提取试剂盒购自Axygen公司，凝胶回收试剂盒购自Qiagen公司，ladder购自Fermentas，PCR引物由大连宝生物公司设计合成，AFP一抗购自CST公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA干扰靶点的选择 靶点序列通过https：//rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/网站软件设计，由英俊公司合成。模板中的loop结构选用了TTCAAGAGA以避免形成终止信号。正义链模板的5'端添加T，与BbsI酶切后形成的粘端互补;反义链模板的5'端添加AGCT，与XhoI酶切后形成的粘端互补。正义链：5'-T-(GN18)-(TTCAAGAGA)-(N18C)-TTTTTTC-3'，反义链：3'-A(CN18)-(AAGTTCTCT)-(N18G)-AAAAAAGAGCT-5'。按此规则选择干扰靶 点 为：AFP-639：5'TGGTCTATCTCCAAATCTAAACTTCAAGAGTTTAGATTTGGAGATAACCTT TTTTC3';3'ACCAGATAGAAATTTGAAGTTCTCTCAAATCTAAACCTCTATCTGG AAAAAAGAGCT5'。

1.2.2 质粒的构建 取oligo溶液5ul，在PCR仪上处理后得到浓度为10 μM的 shRNA模板，将所得模板溶液稀释为200nM，用于连接反应。取 pPll3.7载体 10ug，10×Buffer R10ul，XhoI酶 5ul，Hpa I酶 2ul，加双蒸水至 100ul体系，37℃酶切1小时，琼脂糖电泳，使用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver 2.0(TaKaRa) 回收。按 10×T4 Ligation Buffer 2ul，pll 3.7(XhoI+Hpa I)，shDNA template(100nM)，T4 DNA ligase各1ul，加水至20ul，22℃反应1小时后转染JM 109 competent cells进行连接反应，每个连接反应挑取5个菌落，接种到含50 ug/ml Ampicillin的LB培养集中，使用碱裂解法抽提质粒，所得质粒分别用Xba I和Nhe I进行双酶切鉴定，并进行测序鉴定。

1.2.3 病毒载体的包装与纯化 制备慢病毒包装系统中4种质粒DNA溶液，当293 T细胞密度达60%～70%时将DNA和磷酸钙混合液转移至含单层细胞的培养液中混匀，培养12小时后弃去培养液，加PBS 15 ml轻摇后弃去，重复该步骤3次，加入含100 ml/L小牛血清的细胞培养液15ml，继续培养72小时，收集细胞上清液，将上清液4℃、4000g离心10分钟，收集上清液并以0.45 μm滤器过滤后，4℃、25000 r/min离心20分钟，弃上清液，用500ul PBS重悬病毒沉淀于4℃保存过夜。

1.2.4 HepG2细胞病毒转染 六孔板接种细胞，感染实验分为空白对照组、阳性质控组、模型细胞组 (AFP-639)，细胞换液，吸弃培养基，分别添加1.0ml含2%FBS、不含抗生素的DMEM培养液;同时加入病毒粗提液500ul，24小时后弃上清液，换含10%FBS的DMEM培养液，倒置显微镜及荧光显微镜下观察细胞，拍片。继续培养96小时后，收集细胞，抽提RNA和蛋白。RT-PCR及Western blot检测转染后HepG2细胞 (模型细胞)内AFP基因及蛋白的表达情况。

1.3 统计学方法 采用SPSS 12.0软件进行统计分析，计量资料以(±s)表示，组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 质粒用Xba I和Nhe I进行双酶切鉴定结果 见图1。

图1 质粒用XbaI和NheI双酶切鉴定结果

2.2 测序鉴定结果 见图2。

图2 测序鉴定结果

2.3 转染后大量HepG2细胞呈现绿色荧光 见图3。

图3 转染后镜下所见HepG2细胞

2.4 RT-PCR检测转染后HepG2细胞内AFP基因表达情况

见图4。如图，与正常组NI组 (野生型HepG2细胞)比较，干扰后模型细胞AFP基因的表达显著减少，显著抑制了AFP基因表达。

图4 RT-RCP检测转染后HepG2细胞内AFP基因表达

2.5 实时荧光定量PCR检测模型细胞及其传代后细胞内AFP基因表达 结果见表1。

表1 模型细胞AFP基因表达结果比较(±s)

表1 模型细胞AFP基因表达结果比较(±s)

与野生HepG2组比较，*P＜0.01，与M1组比较，#P＞0.05

组别 AFP/β-actin野生HepG2组1±0 M1(细胞传1代) 0.157±0.025*M5(细胞传5 代) 0.167 ±0.015*#

2.6 Western blot检测模型细胞及其传代后细胞内AFP蛋白表达结果 见表2、图5。

表2 模型细胞内AFP蛋白表达结果比较(±s)

表2 模型细胞内AFP蛋白表达结果比较(±s)

与野生HepG2组比较，*P＜0.01，与M1组比较，#P＞0.05

组别AFP/GAPDH野生HepG2组1.38 ±0.025 M1(细胞传1 代) 0.24 ±0.119*M5(细胞传5 代) 0.22 ±0.023*#

图5 传代后细胞内AFP表达结果

3 讨论

RNAi是由作用于同源序列mRNA的双链RNA所介导的序列特异性、转录后基因沉默机制［2］;具有费用低廉、抑制效率高、容易筛选靶序列等特点，克服了以往反义核酸技术代价高昂、靶序列筛选困难等缺点［3］。siRNA表达载体有质粒表达载体和病毒表达载体两种，目前普遍认为腺病毒载体是一种高效的体内转染载体［4］。当前在国内有一些关于靶向AFP基因干扰的相关报道，或是构建干扰质粒［5］，或是观察RNA干扰对肝癌细胞的影响［6］，但到目前为止还没有关于靶向AFP基因干扰构建不表达或少表达AFP的人肝癌HepG2细胞株的报道。在本研究中，我们通过软件设计了4个靶序列，腺病毒少量包装转染后检测AFP基因及蛋白的表达，靶点“639”干扰效率最高，故选此干扰靶点构建细胞模型。此细胞模型传代后仍能稳定地沉默AFP表达，为进一步对AFP进行机制研究和药理研究奠定了基础。

［1］BOIS-JOYEUX B，THOMASSIN H，RICHARD F，et al.Several transcription factors participate in the functioning of the alpha-fetoprotein gene promoter［J］.Bull Cancer，1995，82(7)：541-550.

［2］AGRAWAL N，DASARADHI P V，MOHMMED A，et al.RNA interference：biology，mechanism，and applications［J］.Microbiol Mol Biol Rev，2003，67(4)：657-85.

［3］HARBORTH J，ELBASHIR SM，VANDENBURGH K，et al.Sequence，chemical，and structural variati-on of small interfering RNAs and short hairpin RNAs and the effect on mammalian gene silencing［J］.Antisense Nucleic Acid Drug Dev，2003，13(2)：83-105.

［4］VORBURGER SA，HUNT KK.Adenoviral gene therapy［J］.Oncologist，2002，7(1)：46-59.

［5］亓同钢，汪运山，王芳，等.AFP基因SiRNA表达质粒的构建及鉴定［J］.山东大学学报(医学版)，2004，42(3)：353-354，358.

［6］张国英，杨慧，刘明社，等.RNA干扰抑制HepG2细胞AFP基因表达实验方法建立［J］.长治医学院学报，2006，20(4)：241-243.