合并非酒精性脂肪性肝病的HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者临床特征和肝组织中脂联素的表达*

刘友德 王 英 王艳娜 范 璐 王明兰 华正中 刘玉翠 邹志强

烟台市传染病医院医疗七科 (山东烟台，264001)

为了解合并NAFLD的HBeAg阴性慢性乙型肝炎(CHB)患者的临床特征及其肝组织中脂联素的表达情况，我们进行了本研究，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2009年1月-2010年12月在烟台市传染病医院接受肝组织穿刺活检并经肝组织学病理检查证实合并NAFLD的HBeAg阴性CHB患者39例，列为脂变组，其中男 31例，女8例，年龄(40.41±10.11)岁;以同期接受肝组织穿刺活检但不伴NAFLD的HBeAg阴性CHB患者54例列为对照组，其中男31例，女23例，年龄 (39.48±10.12)岁。诊断标准：HBeAg阴性CHB诊断标准符合文献［1］;NAFLD 诊断标准符合文献 (2010 版)［2］。排除标准：①合并药物性肝炎、其他的病毒性肝炎、人类免疫缺陷病毒感染者;②大量饮酒者 (折合乙醇男＞40g/d，女＞20g/d);③合并自身免疫性肝病;④患有进展期恶性肿瘤者;⑤存在肝穿 (活检)禁忌症 (出血倾向、腹水等);⑥年龄＜16周岁者。全部研究对象均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 临床评估 询问患者的家族史、饮酒史、糖尿病史、高血压病史和抗病毒药物服用史等，测量患者身高、体重，并计算体重指数 (BMI)，BMI=体重 (kg)/［身高 (m)］2，根据亚洲标准，BMI≥25诊断为肥胖［2］。

1.2.2 实验室检查 肝活检当天留取空腹血标本，采用美国雅培公司CI8200全自动生化免疫分析仪及其原装试剂检测血清肝脏生化学指标，包括丙氨酸氨基转移酶 (ALT)、总胆红素 (TBil)、总胆固醇(TCh)、低密度脂蛋白 (LDL)、甘油三酯 (TG)、空腹血糖 (Glu)、凝血酶原活动度 (PTA)等。采用实时荧光定量PCR法检测HBV DNA定量，用美国ABI公司PE7500荧光PCR检测仪，试剂购自深圳匹基生物工程有限公司，最低检测下限为1×103copies/ml。

1.2.3 肝组织学检查 采用B超引导下自动活检枪经皮穿刺技术取肝组织，要求肝活检组织长度1.0～1.5cm，直径约1mm且无破碎。肝组织采用中性甲醛溶液及时固定，石蜡包埋，4μm连续切片，分别用于苏木精伊红染色 (HE)、Masson染色、网状纤维组织染色、脂联素免疫组织化学染色。脂联素一抗浓度为1∶160，兔抗人脂联素多克隆抗体及DAB试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司;操作按说明书进行。免疫组化结果采用美国Media Cybernetics公司的Image-Pro Plus 6.0系统分析脂联素积分光密度值 (IOD值)，在400×光镜下每张随机选取5个视野进行检测，检测结果取均值。另外，依据HE、Masson及网状纤维组织染色由同一名病理医师对肝脏炎症分级 (G)、纤维化分期 (S)及脂变分级(F)进行盲法评分。慢性肝炎的分级分期标准参照文献［1］，脂变分级根据含脂肪滴的肝细胞数占所获取肝组织样本量的比值进行评估：＜5%的肝细胞脂变为0级;5% ～＜33%为1级;33% ～＜66%为2级;66%及以上为3级，1级及以上为合并肝细胞脂肪变［2］。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量资料服从正态分布者采用均数±标准差表示，不服从正态分布者采用中位数 (最小值，最大值)表示;均数比较采用t检验，中位数比较采用秩和检验;构成比的比较采用χ2检验或Fisher精确概率法;相关分析采用Spearman秩相关检验。

2 结果

2.1 两组患者肝组织中脂联素的表达 脂联素主要在脂变肝细胞的胞膜、脂变周围细胞的胞质、中央静脉周围肝细胞胞浆中表达 (见插页图1)。合并NAFLD的 HBeAg阴性 CHB患者脂联素 IOD值106.95(0.00，802.45) 高于对照组 42.79(0.00，3080.57)，但两组比较差异无显著性意义 (z=1.042，P=0.298)。

2.2 两组患者肝组织脂变的相关因素 详见表1和表2。

将血清TG水平与肝组织脂变程度进行相关分析发现，两者呈正相关且两组比较差异有显著性意义，Spearman秩相关系数 r=0.397，P ＜0.001。

2.3 两组患者不同炎症分级及纤维化分期者肝脏脂联素表达的差异 见表3。

表1 HBeAg阴性CHB患者肝组织脂变相关因素单因素分析

3 讨论

我国属HBV感染高流行区，随着生活水平升高，NAFLD发病率日渐增多，两者常合并出现，既往对CHB合并NAFLD的研究结果存在争议。有研究［3］认为CHB合并NAFLD的发生主要与病毒因素有关，HBV X蛋白 (HBX)的增强表达，可导致肝细胞中脂质积累。另一项研究［4］显示，NAFLD与 BMI和ALT相关，而ALT水平与HBV DNA水平相关，因此认为CHB合并NAFLD的发生是由代谢因素和病毒因素的双重作用引起的。而 Altiparmak等［5］认为 CHB合并NAFLD的发生是宿主代谢因素 (如年龄、BMI和血脂等)所致，而非病毒因素 (如HBV DNA和HBeAg)影响的结果。吴创鸿等［6］对56例CHB合并NAFLD患者 (观察组)和63例单纯CHB患者 (对照组)进行研究，发现观察组HBV DNA水平低于对照组，肝脏炎症及纤维化程度较轻，提示NAFLD与HBV无直接关系，ALT升高可能为NAFLD的结果，考虑抗病毒治疗宜慎重。本研究中，单因素分析发现，合并NAFLD的HBeAg阴性的CHB患者中男性比例、肥胖者比例、BMI、血清ALT、TCh、TG水平均高于对照组，多因素分析提示只有男性和高TG水平与NAFLD有关，且血TG水平与肝细胞脂变程度呈正相关;提示HBeAg阴性CHB合并NAFLD的发生同样是宿主代谢因素所致而非病毒因素影响的结果，与Altiparmak等及吴创鸿等的结果相似。本研究还发现合并NAFLD的HBeAg阴性CHB患者的ALT水平高于对照组，提示NAFLD的发生可能加重了HBeAg阴性CHB患者的肝损伤，此类患者ALT升高可能为NAFLD的结果，考虑抗病毒治疗宜慎重。

研究显示，脂联素可以通过增强游离脂肪酸的β氧化和减少肝细胞合成新的游离脂肪酸，从而阻止脂质的积累，另外也可以通过抑制肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的合成和释放阻止肝脏炎症和纤维化的进展，NAFLD的炎症及纤维化等级与血浆脂联素水平呈负相关［7，8］。本研究发现，对照组炎症轻微者脂联素表达强于炎症明显者，提示脂联素可能是对抗患者肝损伤的防护性因子，与脂变组比较差异并无显著性意义，推测NAFLD的存在可能促进了脂联素的分泌。但有趣的是，尽管合并NAFLD的HBeAg阴性CHB患者脂联素的表达强于对照组，但两组比较差异并无显著性意义，提示脂联素与CHB合并NAFLD患者的关系尚需要进一步的研究。

鉴于目前CHB与NAFLD之间相关性及其机制的研究尚未达成共识，尤其是关于HBeAg阴性CHB合并NAFLD的研究资料甚少，同时各种细胞因子与CHB合并NAFLD之间的关系及其作用机制还不明确，尚需广大同道进一步研究探讨。

［1］中华医学会肝病学分会，感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南［J］.中华肝脏病杂志，2005，13(12)：881-891.

［2］中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组.非酒精性脂肪性肝病诊疗指南 ［J］.中华肝脏病杂志，2010，18(3)：163-166.

［3］KIM K，KIM KH，KIM HH，et al.Hepatitis B virus X protein induces lipogenic transcription factor SREBP1 and fatty acid synthase through the activation of nuclear receptor LXRalpha ［J］.Biochem J，2008，416(2)：219-230.

［4］PENG D，HAN Y，DING H，et al.Hepatic steatosis in chronic hepatitis B patients is associated with metabolic factors more than viral factors ［J］.J Gastroenterol Hepatol，2008，23(7 Pt 1)：1082-1088.

［5］ALTIPARMAK E，KOKLU S，YALINKILIC M，et al.Viral and host causes of fatty liver in chronic hepatitis B ［J］.World J Gastroenterol，2005，11(20)：3056-3059.

［6］吴创鸿，邓启文，董琨，等.慢性乙型肝炎合并非酒精性脂肪性肝病临床和病理分析 ［J］.医学临床研究，2007，24(10)：1669-1671.

［7］ASANO T，WATANABE K，KUBOTA N，et al.Adiponectin knockout mice on high fat diet develop fibrosing steatohepatitis［J］.J Gastroenterol Hepatol，2009，24(10)：1669-1676.

［8］SAVVIDOU S，HYTIROGLOU P，ORFANOU-KOUMERKERIDOU H，et al.Low serum adiponectin levels are predictive of advanced hepatic fibrosis in patients with NAFLD ［J］.J Clin Gastroenterol，2009，43(8)：765-772.