甜味觉对大鼠杏仁中央核1)神经肽Y及FOS表达的影响

朱永香,王 倩,贾 敏,王 爽 ,杨 颖,于 玮,曹 健 ,南 瑛

神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)是由36个氨基酸残基组成的单链多肽,属于胰多肽家族,广泛分布于大脑皮层、纹状体腹侧及背侧以及多个边缘结构包括下丘脑(hypothalamus)和杏仁核(amygdala)[1],是最重要的调节进食的神经肽,具有较强的促食欲作用,NPY的Y1与Y 5受体参与调节NPY对食欲的刺激作用[2]。有研究显示,大鼠摄入含有蔗糖的饲料后脑干的NPY mRNA明显增多[3],说明NPY可能参与了甜味觉信息的评估过程。杏仁中央核是参与味觉信息评估的重要核团,该核团内含有丰富的NPY[1],也含有中等量NPY的Y1受体[4]。由此推测NPY可能参与了杏仁中央核对味觉信息的评估机制,从而调控摄食行为。关于NPY在杏仁中央核是否参与味觉调控的相关报道很少见。为此,本研究采用免疫组织化学方法观察了蔗糖甜味觉刺激对大鼠杏仁中央核内NPY及FOS表达的影响,为进一步探索NPY在中枢神经系统内的促食欲作用及其与肥胖的关系提供形态学依据。

1 材料和方法

1.1 材料 成年健康SD大鼠16只,雄性,体质量 220 g～250 g,自由摄食、饮水,动物房温度维持在(20±3)℃,光暗周期为12 h︰12 h,实验前在上述条件下喂养 2 d。多克隆兔抗大鼠NPY抗体,购自北京博奥森生物技术有限公司,多克隆兔抗大鼠c-FOS抗体(Sc-52)购自美国Santa Cruz公司,SP试剂盒(羊抗兔)及DAB浓缩型试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司。主要仪器有显微镜(O lympus,BX51)、照相机(Spot Insight,U 3.5)、图像分析软件(Image-Pro Plus 6.0)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型及分组 将动物随机分为 2组,每组8只,分别为对照组和实验组。将大鼠禁水20 h后,在 09:30时给予对照组大鼠15 m L蒸馏水,给予实验组大鼠15 m L蔗糖溶液(1 mol/L),30m in后,为了避免大鼠脱水,给对照组及实验组大鼠饮60m in的自来水,连续训练4 d。第5天即实验当天09:30时,给对照组大鼠15 m L蒸馏水,给实验组大鼠15 m L蔗糖溶液(1 mo l/L),饮用30 m in,2 h后腹腔注射乌拉坦(1.2 g/kg)麻醉,打开胸腔,经左心室-主动脉插管,用100 m L生理盐水迅速灌注冲洗血液,40 g/L多聚甲醛固定液(0.1 mol/LPB配制,pH值7.4)400 m L灌流约90m in。断颅取脑,置入固定液,在4℃下保存4 h～6 h,再转入200 g/L蔗糖溶液(0.1 mo l/L PB配制,pH值7.4)在4℃下过夜。做冰冻冠状切片,片厚 40μm,收集于PBS中。

1.2.2 免疫组织化学染色 采用SP免疫组织化学染色,洗脑片(PBS 0.01 mol/L);0.3%(m L/L)H2O2孵育30 min;洗片(5 m in×3),0.3%(m L/L)TritionX-100室温孵育 40 m in;洗片;正常山羊血清封闭,室温60m in;兔抗大鼠NPY抗体(1︰300)孵育脑片,或兔抗大鼠c-FOS抗体(1︰500)孵育脑片,4℃下孵育36 h;洗片;生物素标记羊抗兔IgG(1︰300)室温孵育1 h,洗片;S-A/HRP室温孵育1 h,洗片,DAB显色3 min;PBS冲洗终止反应,裱片、脱水、透明、封片。

1.2.3 图像采集 ①NPY免疫组化图像采集:每只大鼠选取有杏仁中央核连续5张切片,在400倍镜下,每张切片选取杏仁中央核的同一区域拍照。细胞质或细胞膜中出现黄色或棕黄色颗粒为阳性表达细胞。采用图像分析软件(Image-Pro Plus 6.0,IPP 6.0)对NPY免疫阳性物进行半定量检测,测量 NPY免疫阳性细胞总面积(sum of area,SA)和累积光密度(integraloptical density,IOD)。分析过程中所有切片的放大倍数、光源强度均相同。②FOS表达免疫组化图像采集:每只大鼠选取有杏仁中央核连续5张切片,在400倍镜下,每张切片选取杏仁中央核的同一区域拍照。细胞核中出现黄色或棕黄色颗粒为FOS阳性细胞。应用IPP 6.0软件进行图像分析,两侧的平均值作为该核团内特定范围的单侧FOS阳性细胞数。

1.2.4 统计学分析 所有数据用SPSS18.0统计学软件处理,采用均数±标准差(表示,组间比较采用非配对t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠杏仁中央核内NPY表达水平比较(见表1)

2.2 两组大鼠杏仁中央核内NPY免疫组织化学染色(见图1、图 2)

2.3 两组大鼠杏仁中央核内FOS表达水平比较 对照组大鼠杏仁中央核内FOS阳性细胞数20.51±6.53,实验组为44.28±10.49,与对照组相比,给大鼠蔗糖甜味觉刺激后诱导杏仁中央核内FOS免疫反应阳性细胞的表达显著增加(P<0.05)。

2.4 两组大鼠杏仁中央核内FOS免疫组织化学染色(见图3、图 4)

表1 两组大鼠杏仁中央核内NPY表达水平(x±s)

3 讨论

NPY是中枢神经系统含量最丰富的神经肽之一,是最重要的调节进食的神经肽。给大鼠侧脑室、下丘脑室旁核、下丘脑背内侧核及下丘脑其他部位注射NPY,均能导致食欲亢进,尤其富含糖类的食物摄入量明显增加[5,6]。反复注射NPY则引起肥胖。动物饥饿时,下丘脑室旁核中NPY的释放显著增加,哺乳期母体对能量的需求增加,在弓状核-下丘脑室旁核轴中伴随出现NPY能信号增强。因此,普遍认为NPY的增食欲作用是下丘脑调节的,特别是从弓状核发出的投射到下丘脑室旁核的NPY能神经元,NPY的Y1与Y5受体参与调节NPY对食欲的刺激作用[2]。有研究表明,给大鼠第四脑室或侧脑室注射NPY均能增加蔗糖溶液的摄入量,提示NPY的促食欲作用与可口味觉刺激有关[7,8]。Torregrossa 等[9]为了 确定NPY的促食欲作用主要是通过增加可口的甜味觉刺激作用还是由于减弱了消化后的负反馈抑制作用引起的,将NPY分别注入假饲和真饲大鼠的第三脑室,观察到假饲大鼠对蔗糖溶液的摄入量大于真饲大鼠,因此,他们认为NPY的促食欲作用主要是增加可口的甜味觉刺激引起的。有研究证实杏仁核参与味觉及摄食调控[10-12]。其两个重要亚核杏仁中央核(central nucleus of the amygdala,CeA)和杏仁基底外侧核(basolateral amygdala,BLA)在味觉及摄食功能的调控中起不同作用。杏仁中央核起正调控作用,可增加进食量,它对摄食的调控可能是通过食物引起的情感反应而影响对食物的喜好;杏仁基底外侧核进行负调控,可减少摄食量,降低体质量。损毁杏仁中央核的大鼠对各种味觉刺激的摄入量均下降,说明杏仁中央核可能通过影响中枢味觉的评估机制,改变大鼠对不同味觉刺激的欣快阈值,进而调节摄食。由于杏仁中央核内有NPY及其Y1受体的存在,另外,摄食行为在很大程度上是由味觉引导的,因此,我们推测NPY可能也参与了杏仁核对味觉信息的评估机制,从而调控摄食行为。本研究发现,给大鼠1 mol/L的蔗糖甜味觉刺激后引起杏仁中央核内FOS表达的显著增加,提示杏仁中央核内的神经元参与了蔗糖的欣快味觉信息的评估机制;另外,给大鼠1mol/L的蔗糖甜味觉刺激后还引起杏仁中央核内NPY表达的显著增加,提示杏仁中央核内的 NPY能神经元可能参与了蔗糖的可口味觉信息的评估机制。

综上所述,蔗糖的可口味觉刺激可能激活了杏仁中央核内的NPY能神经元,引起NPY的产生和释放增加。因此,有理由推测,NPY在杏仁中央核内可能参与了可口甜味觉食物的促食欲机制。

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