利用手性固定相高效液相色谱法对焦谷氨酸对映异构体的分离
2011-08-28于海云宋俊梅陈志丛
于海云 宋俊梅 陈志丛
焦谷氨酸是一种具有多种天然生理活性的特殊氨基酸,在医药合成研究方面,它可以作为不对称合成的手性源及合成中间体,在生物学、精细化工等相关领域研究中亦有重要地位关的报道[1]。但因其存在D、L-焦谷氨酸两种手性对映异构体,而这两种手性对映体又存在不同的活性和功能差异,因此对其进行拆分研究对于焦谷氨酸的合成研究和生物提取应用研究有着重要意义。
1 仪器与试药
Waters型高效液相色谱仪(美国),PDA检测器;正己烷为色谱纯,异丙醇为色谱纯,冰乙酸为分析纯,三乙胺为分析纯。D-焦谷氨酸(New Jersey,USA);L-焦谷氨酸(四川峨眉山荣高生化制品有限公司)。
2 实验方法与结果
2.1 溶液的制备 精密称取D-焦谷氨酸、L-焦谷氨酸,分别加异丙醇溶解并稀释制成每1 ml中含3 mg的溶液;再精密称取D-焦谷氨酸、L-焦谷氨酸适量,加异丙醇溶解并稀释制成每1 ml中各含3 mg的混合溶液。
2.2 色谱条件 色谱柱:CHIRALPAK AD-H(0.46 cm I.D.×25 cm L),正己烷-异丙醇-冰乙酸-三乙胺(90∶10∶0.1∶0.1)为流动相,进样量:20ul。
2.3 检测波长的选择精密量取供试品溶液20ul,注入液相色谱仪,记录光谱图,结果显示D/L-焦谷氨酸最大吸收在205nm,我们选择205nm作为本品的测定波长。
2.4 分离度试验 精密量取取D-焦谷氨酸、L-焦谷氨酸、D、L-焦谷氨酸混合溶液各20 μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,色谱图见图1、图2、图3。
图1 D-焦谷氨酸色谱图 图2 L-焦谷氨酸色谱图 图3 D、L-焦谷氨酸色谱图
在该色谱条件下,D、L-焦谷氨酸分离度良好。
2.5 最小检出限试验 用显示基线噪音的分析方法,把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较,以信噪比3∶1时确定检测限为0.06 μg。
2.6 精密度试验 精密量取D、L-焦谷氨酸混合溶液20 μl,注入液相色谱仪,连续进样6次,记录色谱图,D-焦谷氨酸RSD为0.61%,L-焦谷氨酸 RSD为0.78%。精密度试验良好。
2.7 稳定性试验 取D、L-焦谷氨酸混合溶液,置暗处放置,分别于 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h 精密量取供试品溶液20 μl,注入液相色谱仪,记录色谱图。D-焦谷氨酸 RSD为0.73%,L-焦谷氨酸RSD为0.70%。供试品溶液在12 h内稳定。
3 结论
利用高效液相色谱法在手型固定相上直接分离焦谷氨酸对映异构体,操作方法快捷简便,精密度高、稳定性好,结果准确可靠,能有效分离焦谷氨酸对映异构体,可用于实际样品的定量分析,此方法具有较高的实用价值。
[1]范毅,冯钰锜,彭剑民.焦谷氨酸对映体的手性高效液相色谱分离.药物分析杂志,2005,25(4).