三七总皂苷对新生大鼠心肌细胞肥大的影响及机制

谢 辉 陶连方

湖北医药学院附属人民医院（湖北十堰 442100）

三七总皂苷对新生大鼠心肌细胞肥大的影响及机制

谢 辉 陶连方△

湖北医药学院附属人民医院（湖北十堰 442100）

目的 在原代培养的新生大鼠心肌细胞上，观察三七总皂苷对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的心肌细胞肥大的影响。方法采用MTT法检测细胞毒性；采用相差显微镜测量细胞大小，3H-亮氨酸掺入法测定心肌细胞蛋白质合成速率作为心肌细胞肥大的指标；RT-PCR检测心肌细胞原癌基因c-fos mRNA的表达。结果三七总皂苷能抑制AngⅡ诱导的心肌细胞增大，蛋白质合成速率的显著增加及心肌细胞原癌基因c-fos mRNA表达的增强，其效果与AngⅡ受体阻滞剂缬沙坦相似。结论三七总皂苷可以抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大，这与其抑制了原癌基因c-fos的表达有关。

血管紧张素Ⅱ 三七总皂苷 心肌细胞肥大 c-fos

△通信作者

三七总皂苷（Panax notoginseng saponin）是五加科植物三七[Panax notoginseng（Burk．） F．H．Chen]的主要活性成分，含量约为12%；可抑制血栓形成，扩张外周血管，保护缺血性心肌细胞损伤，降低血压，治疗心脑血管疾病疗效显著[1-2]。已有研究表明三七总皂苷具有改善心功能保护缺血心脏的作用[3-4]。但其是否从细胞水平影响心肌细胞凋亡而发挥对心肌细胞的保护作用，文献少有报道。为此，本实验以AngⅡ诱导新生乳鼠心肌细胞凋亡为模型[5]，观察三七总皂苷对心肌细胞凋亡的影响，并初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）动物：1～3d龄wistar大鼠，雌雄不拘（湖北医药学院动物实验中心提供）。（2）试剂与仪器 ：AngⅡ（Sigma公司）、三七总皂苷（丽珠集团利民制药厂，批号0711129）、缬沙坦 （北京诺华制药公司馈赠），DMEM干粉培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、TRIZOL（Gibco公司），3H-亮氨酸（中科院上海原子能研究所），RT-PCR试剂盒（TaKaRa公司），PCR引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成，其余试剂为国内目前最优质的化学试剂；Dynatech MR580显微ELISA读数器 （Shimazu）；LS3810液体闪烁仪（Beckman公司）；基因扩增仪（Ferrotec公司）。

1.2 实验分组 （1）对照组；（2）AngⅡ（10-6mol/L）组；（3）AngⅡ（10-6mol/L）＋三七总皂苷 （10-8g/L）组；（4）AngⅡ（10-6mol/L）＋缬沙坦（10-6mol/L）组；（5）三七总皂苷（10-8g/L）组；（6） 缬沙坦 （10-6mol/L）组。

1.3 新生大鼠原代心肌细胞培养 参照文献[6]，在无菌条件下取出大鼠心室，在4℃ D-Hanks液中剪碎，用0.1%的胰蛋白酶消化成单细胞悬液。为了选择性收集心肌细胞，加入20%的DMEM培养液在5%CO2，37℃培养箱中差速贴壁1～2h除去非心肌细胞，吸出未贴壁的心肌细胞稀释成1×105/mL的浓度接种于6孔板，每孔2mL。在培养的前48h，加入0.1mmol/L 5-溴脱氧尿苷抑制非心肌细胞的增殖，然后换无血清培养液。

1.4 细胞毒性的测定 将心肌细胞置于96孔的微孔板培养，更换培养液后，将PBS中加上高浓度的三七总皂苷，孵育24h后，用 MTT 法检测细胞毒性[3]，每孔（10μL/100μL 培养液）加入MTT溶液 （5mg/mL），在37℃中孵育4h，每孔加入酸-异丙醇（100μL,0.04mol/L的HCL于异丙醇中），彻底混匀至深蓝色结晶溶解。在室温下静置几分钟（保证所有的晶体溶解）。然后把培养板置于Dynatech MR580显微ELISA读数器中读数，选用570nm的测试波长和630nm的参照波长。

1.5 心肌细胞大小的测定 心肌细胞在无血清培养液中培养24h后，每24h按分组加药1次，48h换液1次，加药持续作用7d后，0.25%的胰酶消化使之脱落，在相差显微镜下用测微器测细胞直径，每孔观察10个视野，每个视野测10个细胞，取其平均值。

1.6 心肌细胞3H-亮氨酸掺入测定 心肌细胞在无血清培养液中培养24h后，加入AngⅡ、三七总皂苷、缬沙坦和18.3kBq 3H-亮氨酸继续培养24h。弃培养液，PBS冲洗2遍，用0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞于玻璃纤维素膜上，10%的三氯乙酸固定，滤膜烘干后用LS3810液体闪烁仪测定放射强度。

1.7 心肌细胞总RNA提取 收获2×105个心肌细胞，用Trizol试剂提取细胞总RNA。每孔细胞加入Trizol试剂2mL，经氯仿和异丙醇抽提后，将所得的RNA溶于少量无Rnase水中，紫外分光光度计测定其浓度和纯度，重复测定3次，计算样品总RNA浓度：OD260∶280比值在1.8～2.0之间。

1.8 逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR） 采用 Yang等[4]设计的 c-fos 引物 （上游：5′-GGT CAT CGG GGA TCT TGC-3′，下游：5′-GGG CTC TCC TGT CAA C-3′），扩增片段长度为 510bp；内参 β-actin （上游：5′-CCT TCC TGG GCA TGG AGT CCT G-3′，下游 5′-GGA GCA ATG ATC TTG ATC TTC-3′），扩增片段长度为205bp。按照RT-PCR试剂盒的说明，进行目的基因扩增。 RT-PCR 条件为：（1）cDNA 合成和预变性 37℃ 60min，94℃5min；（2）PCR 扩增：94℃ 50s，57℃ 50s，72℃ 50s进行 30 次循环（c-fos扩增10个循环后，再加入内参引物进行余下的20个循环）。 （3）延伸：72℃ 5min。 取 RT-PCR 产物 5μL，加 2μL 上样缓冲液，1.5%琼脂糖凝胶 （含溴化乙锭0.5μg/μL）电泳 25min，用GDS8000凝胶成像分析系统（UVP）扫描定量，并计算与β-actin的比值。

2 结 果

2.1 三七总皂苷和缬沙坦对AngⅡ诱导的心肌细胞大小的影响 见表1。AngⅡ持续作用7d后，心肌细胞直径明显增大（P＜0.05）；三七总皂苷和缬沙坦均能抑制这种心肌细胞大小的改变（P＜0.05）。

表1 各组心肌细胞大小比较 （±s）

表1 各组心肌细胞大小比较 （±s）

与对照组比较，*P＜0.05。与AngⅡ组比较，△P＜0.05。

组 别对照组AngⅡ组AngⅡ+三七总皂苷组细胞直径（μm）18.90±1.80 29.90±3.50*22.10±2.70*AngⅡ+缬沙坦组三七总皂苷组20.00±2.90*19.40±2.80缬沙坦组合成速率（cpm）1210±123 1908±104 1408±110△1368±108△1198±121 1215±12019.10±2.50

2.2 三七总皂苷和缬沙坦对心肌细胞蛋白质合成速率的影响AngⅡ作用24h后，心肌细胞合成速率AngⅡ组较对照组明显增加（P＜0.01），三七总皂苷组和缬沙坦组对心肌细胞蛋白质合成没有影响，但均能抑制AngⅡ刺激的心肌蛋白质合成速率的增加（P＜0.05）。

2.3 三七总皂苷和缬沙坦对原癌基因c-fos mRNA表达的影响在培养液中加入AngⅡ作用30min后，c-fos mRNA的表达显著增强（P＜0.01），预先加入三七总皂苷或缬沙坦作用30min，可阻断AngⅡ的作用（P＜0.01），而三七总皂苷和缬沙坦本身对原癌基因c-fos mRNA的表达无影响。见图1。

图1 三七总皂苷和缬沙坦对AngⅡ诱导的心肌细胞原癌基因c-fos mRNA表达的影响

3 讨 论

许多刺激因子如机械牵张、AngⅡ、内皮素（ET-1）均可引起心肌肥厚[7]。为了探讨三七总皂苷对心肌肥厚的作用，以上实验研究了三七总皂苷对AngⅡ诱导的心肌细胞蛋白质合成速率及原癌基因c-fos mRNA表达的影响，发现三七总皂苷可以减少AngⅡ所致的心肌细胞细胞凋亡，从而抑制心肌细胞肥大，其效果与AT1受体拮抗剂相似。

大量研究表明，三七总皂苷是一选择性的慢钙通道阻滞剂[8-10]，AngⅡ使蛋白激酶C活性增加并伴随胞浆内Ca2+浓度增高[11]，AngⅡ增加Ca2+依赖的内源性核酸酶的活性，导致DNA 断裂[12]，从而导致心肌细胞凋亡。细胞内Ca2+升高被认为是导致细胞凋亡的最后通路，抑制细胞内Ca2+超载可降低细胞凋亡的发生。由此我们推测：三七总皂苷抑制AngⅡ诱导的心肌肥厚可能是通过降低心肌细胞Ca2+变化，阻断MAPK和CaN途径将肥大信号传入核内，从而抑制立原癌基因c-fos mRNA的表达而实现的。

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