参龙健脑胶囊对脑缺血大鼠模型海马CGRP表达的影响*

许成勇 张 岗 黄泉智 孙志高 陈利平 王发渭解放军总医院（北京 100853）

参龙健脑胶囊对脑缺血大鼠模型海马CGRP表达的影响*

许成勇 张 岗 黄泉智 孙志高 陈利平 王发渭△解放军总医院（北京 100853）

目的 探讨参龙健脑胶囊对脑缺血损伤大鼠脑组织海马区降钙素基因相关肽（CGRP）表达的影响。方法用结扎双侧颈总动脉制备缺血性脑损伤大鼠模型，造模成功后随机分为假手术组、模型组、脑复康组及参龙脑胶囊高、低剂量组。灌胃28d后，应用免疫组织化学染色法观察CGRP在缺血脑损伤大鼠海马区的表达。结果与模型组相比，参龙健脑胶囊组大鼠海马区CGRP表达增加。结论参龙健脑胶囊对缺血性脑损伤的保护作用与其促进脑组织CGRP表达密切相关。

参龙健脑胶囊 脑缺血 降钙素基因相关肽 免疫组织化学

缺血性脑血管病（Ischemic cerebral vascular disease，ICVD）是中老年人多发的常见病，其并发症较多，致残率和致死率较高[1]，严重影响人类健康。中药复方以其多靶点、多环节、多途径的作用方式，对缺血性脑损伤患者的症状改善具有一定优势。参龙健脑胶囊是我院治疗ICVD及其并发症的经验方，具有补肾填精、益气活血、化痰醒脑的功效，临床应用具有较好的疗效。本实验通过建立脑缺血大鼠模型，运用免疫组化的方法观察参龙健脑胶囊对脑缺血大鼠海马区降钙素基因相关肽（CGRP）表达的影响，从而探讨其脑保护作用的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级wistar大鼠50只，鼠龄3个月，体质量180～220g，由解放军总医院动物实验中心提供，许可证编号SCXK（京）2009-0007。

1.2 药物及试剂 参龙健脑胶囊（生晒参、制首乌、淫羊藿、石菖蒲、地龙、川芎、远志等组成，解放军总医院中药房提供）；吡拉西坦（脑复康，石家庄中诺药业有限公司）；CGRP免疫组织化学试剂（北京博奥森生物技术有限公司）；二抗检测系统试剂盒（广谱）（基因上海科技有限公司，批号：19J3776A）。

1.3 主要仪器 包埋机 （EG1140H LAICA）；切片机（RM2135 LAICA）；显微镜（0LYMPUS BX60）；Image-proplus 5.1 图像分析软件。

1.4 大鼠脑缺血模型制备 采用双侧颈总动脉永久性结扎法（2-VO）制备脑缺血模型[2]。 大鼠术前禁食、禁水，10%水合氯醛腹腔麻醉（30mg/100g）后，仰卧固定在操作台上，颈前部去毛，碘酒、酒精消毒后沿颈正中线切开，钝性分离皮下组织，气管旁分离出双侧颈总动脉，结扎颈总动脉，逐层缝合伤口。假手术组仅分离双侧颈总动脉而不结扎。在造模大鼠清醒后，按照Longa[3]等的5级评分法，立即进行动物神经功能的评定：正常（0分）；对侧肢体屈曲（1分）；拖鼠尾后拉时，对侧肢体无力（2分）；拖鼠尾后拉时，向对侧转圈（3分）；自发向对侧转圈或倾倒（4分）。选取神经功能评分2分以上者入围实验。

1.5 分组及给药 大鼠分为5组：假手术组、模型组、参龙健脑胶囊小剂量组、参龙健脑胶囊大剂量组、脑复康对照组，在造模成功后第3日开始灌胃给药。将脑复康和参龙健脑胶囊研碎，溶予生理盐水当中，按照陈奇等[4]的方法计算，按参龙健脑胶囊小剂量组、参龙健脑胶囊大剂量组分别含生药80、240g/L、脑复康对照组含脑复康90g/L配制，每次1mL，每日灌胃1次。假手术组和模型组给予等量的生理盐水。连续灌胃28d。

1.6 神经功能评分 造模成功后，分别于术后1、14、28d对各组大鼠进行神经功能评分。

1.7 标本采集与检测 大鼠给药28d后，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，开胸暴露心脏，用生理盐水经左心室快速冲洗，待流出液体清亮后，4%多聚甲醛灌注；断头取脑后，甲醛固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片。采用免疫组织化学染色法（两步法）染色，切片常规脱蜡过梯度酒精；以3%过氧化氢，室温5min灭活内源酶；经微波炉加热抗原修复后滴加稀释后的一抗（兔抗CGRP 1∶250），4℃ 湿盒内过；加入二抗后，置于湿盒中，37°C 温箱内孵育30min；滴加DAB工作液，室温孵育5～10min，光镜下控制显色，水洗终止反应；苏木素衬染、盐酸酒精分化后反蓝；常规脱水、透明、封片。阴性对照用PBS代替一抗。阳性反应产物应呈棕黄色黄色颗粒，显微镜观察并照像，每组取4个标本切片，每张切片随机选取3个高倍视野，计数阳性细胞数。

2 结 果

2.1 神经功能评分 见表1。给药前（术后1d）各治疗组和模型组之间神经功能学评分差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗14d与28d后，与模型组相比，参龙健脑胶囊小剂量组、参龙健脑胶囊大剂量组、脑复康组大鼠的神经功能缺损显著改善（P＜0.05）。

表1 参龙健脑胶囊对脑缺血大鼠神经功能评分的影响 （分）

2.2 参龙健脑胶囊对脑缺血大鼠海马区CGRP阳性细胞数的影响 见表2。 光镜下可见，CGRP反应产物呈棕黄色颗粒状，在细胞膜和细胞浆内表达；阳性细胞主要分布于海马CA1区和CA3区内。模型组大鼠海马CA1区和CA3区内CGRP阳性细胞表达较少，与假手术组相比，有显著差异（P＜0.05或0.01）。而参龙健脑胶囊小剂量组、参龙健脑胶囊大剂量组、脑复康对照组大鼠海马CA1区和CA3区内的CGRP阳性细胞表达明显多于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05或0.01）。

3 讨 论

CGRP是一种含有37个氨基酸的神经肽，广泛分布于中枢和外周神经系统，以及心、脑血管、消化、呼吸和内分泌等系统，具有多种生理调节作用，是一种重要的内源性神经保护物质。CGRP具有很强的扩血管作用，其扩血管作用强于乙酰胆碱、ATP、ADP、5-羟色胺和 SP等，当 CGRP的调控失衡，处于相对低的水平时，血管以收缩为主，血黏度增高，血小板聚集性增强，易于形成缺血性脑血管病[5]。在缺氧情况下 ，CGRP能够阻止细胞外Ca2+内流，防止细胞内Ca2+升高，维持海马神经细胞内Ca2+稳态，降低细胞的死亡率；还可通过降低低氧时海马神经细胞c-fos基因的表达，上调bcl-2的表达以发挥其神经保护作用[6]。研究发现 ，CGRP可促进海马神经细胞的生长发育，而且对大鼠海马区域缺氧损伤具有明显的保护作用，延缓缺氧导致的突触功能不可逆损伤的发生[7]。因此，对CGRP的表达进行干预，防止其调控失衡，是预防和治疗缺血性脑血管病的可能途径之一。

表2 各组脑缺血大鼠海马区CGRP阳性细胞数比较 （±s）

表2 各组脑缺血大鼠海马区CGRP阳性细胞数比较 （±s）

组 别 CA3区CA1区假手术组 19.250±4.330*19.833±3.380**12.583±2.811*参龙小剂量组 16.417±2.778*参龙大剂量组 19.667±3.822*脑复康对照组 20.917±4.641*模型组15.833±3.129**17.083±4.542**19.500±4.275**20.250±3.306**

中医药治疗缺血性脑血管病，多从气虚、血瘀、痰阻等方面立论，认为该病多属本虚标实之患，肾虚为本，为血瘀、痰阻为标，治疗多以补肾活血化痰为基本治法，结合其并发症状及发展分期佐以益气活血、醒脑开窍、清热解毒等法。参龙健脑胶囊由人参、首乌、淫羊藿、地龙、石菖蒲、川芎、远志等药物组成，全方具有补肾填精、益气活血、化痰醒脑的功效，用于缺血性脑血管病证属肾精不足，气虚血瘀痰阻之证。临床实验研究表明，参龙健脑胶囊对于脑缺血及血管性痴呆导致的认知障碍具有较好的改善作用[8]。

本实验研究结果显示：参龙健脑胶囊能够改善模型大鼠脑缺血后的神经功能评分，改善缺血性脑损伤大鼠模型海马神经元细胞的形态及结构。该复方增强脑缺血大鼠脑组织海马区CGRP表达，以调节脑血管的舒缩状态，发挥CGRP对脑缺血大鼠海马神经元缺血损伤的保护作用，是其脑保护作用的可能机制之一。由于缺血性脑损伤的机制较为复杂，影响因素较多，参龙健脑胶囊脑保护作用的具体机制还有待进一步研究。

[1]张茁.缺血性脑卒中的预防[J].中华老年心脑血管病杂志，2006，8（3）：145-147.

[2]Olsson Y，Brun A，Engjnuned E.Fundamental pathological lessions in vasculardementia[J].ActaNeurol ScandSuppl，1996，168（6）：31-38.

[3]Zea Longa E L，Weinstein P R，Carlson S，et al.Reversible middlecerebralarteryocclusionwithoutcraniectomyinrats[J].Stroke，1989，20（1）：84.

[5]陈祖荣，林秋泉，冯华.降钙素基因相关肽与脑血管疾病的关系研究进展[J].中国实用医药，2009，4（6）：6233-235.

[6]丁爱石，王福庄，杨宏，等.降钙素基因相关肽对缺氧时大鼠海马培养神经元 C-fos表达的影响[J].中国神经科学杂志，1997，4（3）：110-1l4.

[7]DcruzBJ，FertigKC，FilianoAJ，etal.Hypothermicreperfusionaftercardiacarrestaugmentsbrain-derivedneurotrophic factor activation [J].J Cereb Blood Flow Metab，2002，22（7）：8436-851.

[8]陈利平，王发渭，贾建军，等.参龙健脑汤治疗轻度认知障碍临床研究[J].中国中医急症，2009，3（18） ：354-355.

Effect ofShenlongjiannao Capsuleon Expression of Calcitonin Gene Related Peptide in Hippocampus of Cerebral Ischemia Rats

XU Cheng-yong，ZHANG Gang，HUANG Quan-zhi，et al Chinese PLA General Hospital（Beijing100853）

Objective：To explore the effects ofShenlongJiannao Capsuleon the expression of calcitonin gene related peptide （CGRP） in hippocampus of cerebral ischemia rats.Methods：Cerebral ischaemia animal models established by ligation of bilateral carotid arteries were divided randomly into the sham-operation group，the model group，the Piracetam group and theShenlongjiannao Capsulehigh dose group and theShenlongjiannao Capsulelow dose group.After 28 days，the CGRP was detected by the histochemical staining method in the hippocampus of cerebral ischemia.Results：Compared with the model group，the CGRP of theShenlongjiannao Capsulegroup was increased.Conclusion：The protective effect ofShenlongjiannao Capsulemay be related to its CGRP expression increase.

Shenlongjiannao Capsule；Cerebral ischemia；CGRP；Histochemical staining method

R285.5

A

1004-745X（2011）09-1428-02

北京市科技计划研发基金课题（Z07050700690709）

△通信作者

2011-04-30）