荧光定量PCR检测肝胆癌组织内HCV RNA含量

屈振亮，崔乃强，赵二鹏

丙型肝炎病毒（HCV）感染是肝癌发生的主要危险因素之一，大量研究证实肝癌组织内可以检测到HCV RNA[1]。有研究发现肝门部胆管癌组织内可检测到HCV 5’末端非编码区(5’NT)序列以及HCV C蛋白的表达[2]，但也有研究并未在肝门部胆管癌组织内检测到HCV标志物[3]，为进一步了解HCV在肝胆肿瘤组织中的存在情况，我们采用荧光定量PCR方法，检测手术切除的新鲜肝胆肿瘤组织内HCV RNA含量。

1 材料与方法

1.1 标本采集 收集我院2009年7月—2011年7月间手术切除的胆道肿瘤14例，其中肝门部胆管癌10例，胆囊癌2例，胆管下端癌2例；肝癌11例，其中肝细胞癌10例，肝内胆管细胞癌1例。另取病毒性肝炎组织6例，作为对照。手术切除的新鲜标本，切成1 cm×1 cm大小，液氮内快速冷冻后，置-80℃保存。

1.2 血清抗-HCV检测 抗-HCV诊断试剂盒购自上海科华生物工程有限公司，包被抗原含有HCV结构区核心抗原及非结构区抗原。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测HCV抗体。

1.3 组织RNA提取 采用SV Total RNA Isolation System（Promega）提取组织总RNA，按试剂盒说明进行操作，提取的组织RNA溶解在无核酶水，经Bio Photometer蛋白核酸测定仪（Eppdorf）定量，上样前将样本量稀释至0.5 μg/μL。

1.4 HCV RNA定量检测 HCV核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）购自上海科华生物工程有限公司。RT-PCR扩增反应液配制：PCR主反应液:酶混合液:荧光探针=7∶5∶0.5，混匀后分装在PCR毛细反应管，每管12.5 μL。每个反应管加入样本量12.5 μL，共50 μL，逆转录与扩增一步完成，同时设阴性对照、强阳性和弱阳性对照、4个工作标准品。PCR扩增反应液和样本液混合后离心15 s，置LightCycler®480扩增仪（Roche）进行扩增反应，反应条件为：50℃25 min后94℃预变性2 min，93℃3 s、55℃ 15 s、72℃ 15 s共5个循环，随后93℃ 3 s、60℃45 s共42个循环，最后40℃30 s完成扩增反应。荧光检测通道选择F1。

1.4 结果判定 阴性对照的测定结果为0，工作品测定值的线性相关系数≥0.95。测定值＜500 copies/mL判定为结果阴性，而≥500 copies/mL判定为阳性。

2 结果

2.1 胆道肿瘤患者血清抗-HCV和组织HCV RNA阳性率 本组14例胆道肿瘤患者，无1例抗-HCV阳性，而且检测的组织HCV RNA亦无1例阳性。胆道肿瘤患者的临床资料及血清抗-HCV、组织HCV RNA检测结果见表1。

表1 14例胆道肿瘤患者的临床资料及HCV检测结果

2.2 肝癌和肝硬化患者血清抗-HCV和组织HCV RNA阳性率 本组11例肝癌和6例肝硬化患者血清中，各有1例抗-HCV阳性，而检测的其相应组织内HCV RNA阳性，见表2。1例肝内胆管细胞癌患者血清中乙型肝炎病毒（HBV）和HCV标志物均阴性，但其余9例肝癌患者和5例肝硬化患者血清HBV标志物阳性。

3 讨论

HCV是肝癌发生的主要危险因素之一，但是否也是胆管癌发生的危险因素，观点不一，争议很大。虽有部分研究发现在肝门胆管癌组织内可检测到HCV RNA和核心蛋白的表达，但以上海市人群为对象的病例对照研究发现HCV在人群感染率约2%，不能确定胆管癌发生与HCV有关[4]。一组对美国退役军人的队列研究发现[5]，感染HCV的人群罹患肝癌的风险比是15.09，肝内胆管癌的风险比是2.55，但患肝外胆管癌的风险比只有1.50，因此认为HCV感染与肝外胆管癌发生关系不大。我们曾回顾调查天津地区的肝外胆管癌病例资料发现[6]，抗HCV阳性率在胆管癌患者中为4.3%，在良性胆道疾病中为5.6%，同样不能明确HCV感染与胆管癌发生间的相关性。但值得我们关注的是，有研究将HCV C基因转染胆管癌细胞，发现C蛋白能激活NFκB信号通路[7]，并能诱导胆管细胞发生上皮-间叶样转化[8]。是否HCV感染与胆管癌发生有关是有待继续深入探讨的问题，我们对收集的14例胆道肿瘤组织行荧光定量PCR检测HCV RNA，结果无1例阳性。在检测的11例肝癌和6例肝炎组织中，也仅有2例阳性，且阳性的标本正是来自血清抗-HCV阳性的病例。我们的结果与另一项研究结果一致，该研究采用微粒酶免疫分析法检测了73例肝门胆管癌、26例远端胆管癌患者的抗-HCV，结果无1例阳性[3]。我们采用目前临床上常用的、特异性高的荧光定量PCR方法检测新鲜提取组织的HCV RNA，远较采用原位PCR或RT-PCR方法从石蜡包埋组织检测HCV 5’非编码区出现的假阳性率低，且结果更可靠。由于易被RNA酶（RNAase）降解，其实HCV RNA检测率很低，极易出现假阴性结果。但如果标本处理不当、操作中污染等因素，又容易出现假阳性结果。因此，检测组织HCV RNA阳性时，一定与血清抗-HCV结果进行比较，必要时需反复检测，以避免假阳性或假阴性结果的出现[9]。本组中2例组织HCV RNA阳性的病例，其血清抗-HCV阳性，进一步说明检测结果的真实可靠。由于目前常用的荧光定量PCR方法测定的基值为500 copies/mL，必将影响到HCV RNA的阳性检出率，这或许就是该法较原位PCR或RT-PCR方法检出率低的原因之一。HCV RNA检出率低的另一原因与我国HCV流行情况有关。我国乙型肝炎病毒（HBV）感染流行远较HCV广泛，前者为57.6%，后者仅为3.2%[10]，HBV与肝门部胆管癌发生间的关系似乎较HCV密切，我们曾用Alu-PCR方法检测本组中的10例肝门部胆管癌标本中HBV整合情况，发现近一半的标本可检测到HBV基因整合[11]。

表2 肝癌和肝硬化组织HCV RNA检测情况

总之，从本研究结果及我们既往流行病调查结果看，胆道肿瘤组织内HCV抗体和RNA检出率极低，HCV是否是胆管癌发生的一个危险因素，尚难定论。

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