肠出血性大肠杆菌O157∶H7脂多糖抗原的提取鉴定及间接ELISA法的建立

刘红亮,陈学忠,李克生,杜惠芬,陈应泰,连晓雯,鲁学萍,袁 明,叶文华

2.甘肃省医学科学研究院,兰州 730050;

3.兰州大学临床医学院,兰州 730030

肠出血性大肠杆菌O157∶H7脂多糖抗原的提取鉴定及间接ELISA法的建立

刘红亮1,陈学忠2,李克生2,杜惠芬2,陈应泰3,连晓雯2,鲁学萍1,袁 明2,叶文华2

目的提取并纯化具有强免疫反应性和高特异性的肠出血性大肠杆菌O157∶H7(E.coliO157∶H7)脂多糖(LPS)抗原,并研究其在E.coliO157∶H7 LPS抗体检测中的应用。方法应用热酚水法提取E.coliO157∶H7 LPS抗原,同时收集水相和酚相LPS,并对其产率、纯度及免疫反应性进行分析比较,用酸解法制备O-特异性多糖(O-SP),并以不同的LPS为包被抗原,建立间接ELISA法检测E.coliO157∶H7 LPS抗体。结果大分子量的E.coliO157∶H7 LPS优先溶于酚相,而水相中含有更多的小分子量LPS,与水相LPS相比酚相LPS具有更高的免疫反应性和纯度,酚相LPS经酸解去脂得到的O-SP具有更高的反应特异性。结论酚相LPS和O-SP都可用于E.coliO157∶H7 LPS抗体的ELISA检测,O-SP具有更高的特异性,是检测E.coliO157∶H7 LPS特异性抗体的理想材料。

大肠杆菌 O157∶H7;热酚水法;脂多糖;O-SP;间接 ELISA

2.甘肃省医学科学研究院,兰州 730050;

3.兰州大学临床医学院,兰州 730030

肠出血性大肠杆菌O157∶H7(E.coliO157∶H7)是一种严重危害人类健康的食源性病原菌,由于其具有高致病性和高毒力,近年来被公众所关注。脂多糖(LPS)是E.coliO157∶H7细胞壁的重要组成部分,由类脂A、核心多糖和O特异性多糖(OSP)组成,E.coliO157∶H7的特异性O抗原位于LPS的O-SP上。该菌感染患者,可诱导机体产生特异性抗O157抗体[1],LPS抗原可用于对E.coliO157的血清学诊断[2],另外E.coliO157 LPS也被广泛地应用于E.coliO157特异性单克隆抗体的制备[3-4]。制备高质量的E.coliO157∶H7 LPS抗原并建立灵敏度高、特异性强的针对E.coliO157∶H7 LPS抗体的ELISA检测方法是对该菌进行血清学诊断及制备E.coliO157∶H7 LPS特异性单克隆抗体的基础。针对国内实验室在热酚水法中对酚相LPS的忽视,本实验在常规热酚水法的基础上同时收集了水相和酚相LPS,分别对其性质进行分析研究,并初步建立了E.coliO157∶H7 LPS抗体的间接ELISA检测方法。

1 材料

1.1 菌种及抗体 大肠杆菌O157∶H7(NCTC 12900)菌种由珠海出入境检疫局提供,E.coliO157∶H7 LPS单克隆抗体4B2(McAb4B2)和单克隆抗体7F9(McAb7F9)及鼠E.coliO157∶H7高免血清由甘肃省医学科学研究院医学生物中心提供,兔E.coliO157诊断血清由兰州生物制品研究所提供。

1.2 主要生化试剂 苯酚、蒽酮、高碘酸、聚乙二醇20 000、无水乙醇均为国产分析纯;胰蛋白胨、酵母抽提物(OXOID公司);牛血清白蛋白(BSA)(北京利科恒达科贸有限公司);十二烷基磺酸钠(SDS)、T ris碱(华美公司);丙烯酰胺、双丙烯酰胺(Merck公司);辣根过氧化物酶标记羊抗鼠 IgG(羊抗鼠IgG-HRP)、羊抗兔IgG-HRP(北京博奥森生物制品有限公司);碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG(羊抗鼠IgG-AP)(sigma公司);Hybond c-Extra硝酸纤维素(Amersham Biosciences公司);5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐/四唑硝基蓝(BCIP/NBT)底物(Promega公司)。

1.3 仪器设备 电热恒温水浴锅(北京长风仪器仪表公司),酶标检测仪(T hermo Labsystems),洗板机(Thermo Labsystems),低温冷冻离心机(Beckman),高速离心机(Eppendorf),电泳仪、垂直板槽(bio-rad),UV-120-2紫外可见风光光度计(shimadzu),超声波破碎仪(上海之信仪器有限公司)。

2 实验方法

2.1 菌体制备 取E.coliO157∶H7菌种划线接种于LB平板培养基,37℃培养15h,挑取单个典型菌落接种于1 000mL LB培养基,37℃,200r/min摇床培养24h,然后 80℃,30min灭活,离心收集菌体,用灭菌0.9%NaCl洗涤3次,称菌体湿重,加入4倍重量的去离子水,悬起细菌,-20℃保存备用。

2.2 LPS制备 热酚水法参考Westerman等[4]并做适当改进。菌悬液反复冻融4次,然后超声破碎,水浴加热至72℃,与等体积72℃的88%的苯酚混合,72℃水浴30min,每隔数分钟剧烈搅拌一次,取出冷却至室温,3 000 r/min离心20min。收集上层水相,下层酚相加等体积去离子水重复抽提1次。合并水相,加入10mL 88%苯酚重复抽提1次。弃去中层变性蛋白,分别收集酚相和水相,然后流水透析48h去酚,去离子水透析24h,4～5h换水1次,用25%聚乙二醇20 000浓缩至原体积的1/4,离心弃沉淀。上清加入无水乙醇使其终浓度为25%,4℃过夜,12 000r/min离心20min,弃去核酸沉淀。上清中继续加入无水乙醇使其终浓度为85%,用NaOH调节pH至8.5～9.0,4℃静置2h,8 000r/min离心20min,收集沉淀称重,分别用去离子水溶解沉淀,使产物的浓度为10mg/mL,标记为酚相LPS和水相LPS,-20℃保存备用。

2.3 O-SP的制备 酚相LPS溶液中加入冰醋酸使其终浓度为2%,100℃水浴1h,12 000r/min离心20min,弃沉淀(类脂),取上清,去离子水透析24h去酸,25%聚乙二醇20 000浓缩至原体积,标记为O-SP,-20℃保存备用。

2.4 多糖含量的测定 蒽酮-硫酸法测定LPS糖含量,以葡萄糖为标准品绘制标准曲线。

2.5 蛋白含量的测定 Bradford法测定,以BSA为标准品制作浓度标准曲线。

2.6 SDS-PAGE电泳分析及Western-blot鉴定

2.6.1 SDS-PAGE 浓缩胶为 4%,分离胶为12%,采用 2.5μ g 、5μ g 和 10μ g 三个上样量 ,60V 电压直至样品进入分离胶,然后以150V电泳至溴酚蓝迁移到分离胶末端。LPS银染方法参考徐先栋等[5]方法。

2.6.2 Western-blot 20μ g的酚相 LPS进行SDS-PAGE电泳,然后电转印至硝酸纤维素薄膜上(200mA,电转印60min),电转移后将膜于含5%脱脂奶粉的 TBST(20mmol/LTris-Cl,pH7.4,150mmol/L NaCl,0.5%Tween-20)溶液中室温封闭1 h,TBST洗3次(每次5min);将膜分别浸于McAb4B2腹水(1∶200稀释,稀释液为含5%脱脂奶粉的TBST溶液)和McAb7F9腹水(1∶200稀释),室温轻摇1 h,TBST洗膜3次(每次5min);加二抗(1∶2 000稀释的羊抗鼠IgG-AP,稀释液为含5%脱脂奶粉的TBST溶液),室温轻摇1 h,TBST洗膜3次(每次 5min);加入 BCIP/NBT显色液(用前现配),室温下避光显色,蒸馏水终止反应。

2.7 琼脂糖凝胶电泳 应用1%琼脂糖凝胶(含0.5μ g/mL溴化乙锭)对LPS样品进行电泳分析,5μ L LPS样品加入1μ L loading buffer,80V 恒压电泳20min后在紫外下进行观察。

2.8 间接ELISA法检测E.coliO157:H7 LPS抗体 间接ELISA检测方法参考照文献[6],用方阵滴度法确定抗原包被浓度和酶稀释度,用酚相、水相LPS和O-SP包被酶标板,检测E.coliO157:H7鼠高免血清、兔E.coliO157诊断血清及E.coliO157 LPS单克隆抗体。

3 结 果

3.1 LPS产率 菌体湿重4g,纯化后得到水相LPS 28mg、酚相 LPS 13mg,总产率为1.025%。

3.2 LPS多糖含量 采用苯酚一硫酸法以葡萄糖为标准品制作标准曲线:y=122.7x-2.565(R2=0.994),x为A 值(OD580),y为糖含量(μ g/mL),检测样品A值经计算水相LPS溶液和酚相LPS溶液糖含量分别为690μ g/mL 和1 870μ g/mL,水相LPS和酚相LPS沉淀中含糖量分别为6.9%和18.7%。

3.3 LPS蛋白含量 Bradford法测定,以BSA为标准品制作浓度标准曲线:y=1020x+2.023(R2=0.988),x为A值(OD590),y为蛋白含量(μ g/mL),检测样品A值经计算水相LPS溶液和酚相LPS溶液蛋白含量分别为 180μ g/mL 和 56μ g/mL,水相LPS和酚相LPS沉淀中蛋白含量分别为1.8%和0.56%。

3.4 SDS-PAGE电泳银染及Western-blot结果

图1为银染和免疫印迹结果。从图中可以看出,E.coliO157∶H7 LPS SDS-PAGE电泳程典型的阶梯状条带在10-60kd之间都有分布,其中在35-60kd和10-20kd有集中分布。大分子量的E.coliO157∶H7 LPS主要分布于酚相,而水相中含有更多的小分子量LPS。Western-blot结果显示,大分子量LPS和小分子量LPS都能与核心抗原单克隆抗体(McAb4B2)结合,然而只有具有大片段O-侧链的LPS与O-特异性多糖单克隆抗体(McAb7F9)有良好的反应性。

图1 LPS银染与免疫印迹结果Fig.1 SDS-PAGE analysis and Western-blot analysis of LPS

3.5 琼脂糖凝胶电泳结果 图2为LPS琼脂糖凝胶电泳结果,从图中可以看出,水相LPS中含有大量的长度在100bp左右的小片段核酸,酚相LPS中只含有少量的核酸,经酚相LPS酸解得到的O-SP几乎不含核酸杂质。

图2 LPS样品琼脂糖凝胶电泳结果Fig.2 Agarose Gel Electrophoresis analysis of LPS

3.6 ELISA检测结果 将水相LPS、酚相LPS、OSP稀释至 1μ g/mL包被酶标板,相当于每孔0.1μ g/mL,羊抗鼠IgG-HRP最佳稀释度为1∶40 000,羊抗兔IgG-HRP最佳稀释度为1∶20 000,检测鼠高免血清、兔E.coliO157诊断血清及E.coliO157∶H7 LPS单克隆抗体结果见表1。

4 讨 论

热酚水法由于操作简单,经进一步纯化后可得到纯度较高的 LPS,因此被大多数实验室所采用,但是国内实验室普遍存在对酚相LPS忽略的问题,因此本实验分别收集了酚相和水相LPS,并分别对其特性进行研究和讨论。

本实验水相LPS和酚相 LPS的收率分别为0.7%和0.325%,总收率为1.025%,高于宋宏新[7]等0.5%的收率,本实验不仅收集了水相LPS也收集了酚相LPS,因此总收率有明显的提高,除此之外杂质含量、菌种及培养条件也对收率有一定影响。本实验采用乙醇分级沉淀法去除核酸杂质,琼脂糖凝胶电泳结果显示该方法不能有效除去水相中长度在100bp左右的小片段核酸,宋宏新[7]等利用酶解法除去核酸杂质,虽然可以有效除去核酸,但是会增加LPS中的蛋白含量,同时也增加了生产成本。潘劲草[8]等利用超速离心法也可除去核酸,但是超速离心对实验设备要求较高,不利于该实验在大多数实验室展开。琼脂糖凝胶电泳结果还表明核酸主要溶于水相,酚相中只含有少量核酸杂质,实验结果也证实经乙醇分级沉淀法除去核酸的酚相LPS可以满足检测的需要,并且在酚相LPS经酸解去脂得到的O-SP中没有检测出核酸。

有研究认为在用热酚水法提取E.coliO157LPS时LPS主要溶于水相[8],本实验中SDS-PAGE银染结果显示大分子量的光滑型LPS(S-LPS)主要分布于酚相,粗糙型LPS(R-LPS)以及O-侧链寡糖重复单位较少的LPS在水相和酚相都有分布,并且在水相分布要多于酚相,该结果与Kim等[9]的报道相一致。Western结果表明,大分子量LPS和小分子量LPS都能与核心抗原单克隆抗体4B2结合,然而只有O-侧链具有一定数量寡糖重复单位的 LPS才与O-特异性多糖单克隆抗体7F9有良好的反应性,LPS western结果与抗体的性质有很大的关系,该结果与Westerman[4]等的报道相一致。

表1 以不同LPS为包被抗原间接ELISA检测结果Table 1 Result of Indirect ELISA with different LPS as antigen

从 ELISA结果可以看出,水相 LPS用于ELISA检测效果不如酚相LPS和O-SP。本实验所采用的间接ELISA是将LPS抗原包被于聚苯乙烯酶标板,LPS与聚苯乙烯酶标板的吸附性是进行ELISA检测的基础,有报道[10]称多S-LPS按常规方法包被能吸附到聚苯乙烯板上,然而R-LPS不能很好吸附于酶标板,在酶联反应各步中按常规方法会逐步将 LPS洗掉。水相LPS主要成分就是 RLPS和O侧链只有较少寡糖重复单位的LPS,因此水相LPS与聚苯乙烯酶标板结合力差是影响其检测结果的主要因素,Appelmelk[11]也曾报道其采用R-LPS与牛血清白蛋白(BSA)复合物进行包被可极大地提高R-LPS的检测灵敏度。核酸电泳结果显示在水相LPS中含有大量100bp左右的核酸分子,核酸杂质含量高也可能是影响水相LPS检测结果的因素之一。酚相LPS和O-SP,并表现出了较高的免疫反应性和灵敏度,说明聚苯乙烯酶标板对酚相LPS和O-SP具有较好的吸附性,同时也说明由热酚水法制的的酚相LPS具有很好的免疫反应性。对两株单抗的检测结果显示,酚相LPS经酸解去脂后不影响其与O-特异性多糖单克隆抗体的反应,而不能与核心抗原单克隆抗体发生反应,因此O-SP具有更高的反应特异性。

脂多糖是革兰阴性菌细胞壁外膜中的重要组成成分,其不仅在细菌感染及疾病演化中具有重要作用,而且是革兰阴性菌重要的表面抗原,因此,近年来有关LPS的研究备受关注。本实验对常规热酚进行了改进,并制备了E.coliO157∶H7 LPS,并用酸解法制备了O-SP,ELISA结果显示酚相LPS和O-SP都可用于E.coliO157∶H7 LPS抗体的检测,其中O-SP具有更高的反应特异性。

[1]Chart H,Smith HR,Scotland SM,et al.Serological identification ofEscherichiacoliO157:H7 infection in haemoly tic uraemic syndrome[J].Lancet,1991,337:138-140.

[2]Laegreid W,Hoffman M,Keen J,et al.Development of a blocking enzyme-linked immunosorbent assay for detection of serum antibodies to O157 antigen ofEscherichia coli[J].Clin Diagn Lab Immunol,1998,5(2):242-246.

[3]Guttikonda S,Tang XL,Yang BM,et al.M onospecific and bispecific antibodies againstE.coliO157 for diagnostics[J].Journal of Immunological Methods,2007,327(1-2):1-9.

[4]Westerman RB,He Y,Keen JE,et al.Production and characterization of monoclonal antibodies specific for the lipopolysaccharide ofEscherichia coliO157[J].J Clin Microbiol,1997,35(3):679-84.

[5]徐先栋,谢珍玉,王世锋,等.脂多糖快速银染检测方法的改良[J].生物技术通报,2009,3:95-97.

[6]Kroll JJ,Eichmey er MA,Schaeffer M L,et al.Lipopolysaccharide-based enzyme-linked immunosorbent assay fo r experimental use in detection of antibodies to Lawsonia intracellularis in pigs[J].Clinical And Diagnostic Laboratory Immunology,2005,12(6):693-699.

[7]宋宏新,刘晓阳,李宏.改良热酚水法制备大肠杆菌O157∶H7脂多糖抗原的研究[J].食品科学,2006,27(10):273-275.

[8]潘劲草,黄志成,余文炳。肠出血性大肠杆菌O157∶H7脂多糖抗原的制备及鉴定[J].中国人兽共患病杂志,1999,15(3):59-61.

[9]Kim S,Burgula Y,Ojanen-Reuhs T,et al.Differentiation of crude lipopolysaccharides from Escherichia coli strains using Fourier transform infrared Spectroscopy and chemometrics[J].Journal of Food Scinece,2006,71(2):57-61.

[10]刘晓波,黄策,严共华.酶联检测中粗糙型脂多糖包被方法的改进[J].中华医学检验杂志,1995(4):242.

[11]Appelmelk BJ,Verweij-Van Vught AM,M acLaren DM,et al.An enzyme-linked immunoso rbent assay(ELISA)for the measurement of antibodies to different parts of the g ram-negative lipopolysaccharide core region[J].J Immunol Methods,1985,82(2):199-207.

Extraction and identification ofE.coliO157∶H7 lipopolysaccharide and development of an indirect ELISA

LIU Hong-liang,CHEN Xue-zhong,LI Ke-sheng,DU Hui-fen,CHEN Ying-tai,LIAN Xiao-wen,
LU Xue-ping,YUAN Ming,YE Wen-hua
(School of Life Sciences,LanzhouUniversity,Lanzhou730000,China)

To obtain lipopolysaccharide(LPS)ofEscherichiacoliO157:H7(E.coliO157:H7)and study the application of LPS in detection of anti-O157:H7 LPS antibody,in the present study the LPS was extracted fromE.coliO157:H7 by the hot phenol-water method and both the aqueous and phenol phases were collected.The yield,purity and immunoreactivity had been investigated,and then the phenol phases LPS was hydrolyzed by acetic acid for getting O-Specific Polysaccharide(O-SP).Indirect ELISA with different LPS as antigen was performed to detect anti-O157:H7 LPS antibodies.The results showed that the high molecular mass LPS was preferentially extracted by the phenol phase,and the aqueous phase contained more low molecular mass LPS.Compared with aqueous phases LPS,the phenol phases LPS has higher purity and immunoreactivity.O-SP has higher reaction specificity,it could be used to detect antibodies ofE.coliO157:H7 LPS.

E.coliO157:H7;hot phenol-water method;LPS;O-SP;indirect ELISA

R378.2

A

1002-2694(2011)07-0637-04

陈学忠,Email:chief.chenxuezhong@163.com

1.兰州大学生命科学学院,兰州 730030;

2011-01-09;

2011-04-26