肺炎支原体ORF6区蛋白重组抗原制备及在血清学诊断中的初步应用

王惠榕,高岚美,萧剑雄,严延生,张春阳

肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)是一种常见的呼吸道病原体,是社区获得性肺炎的主要病原体之一,临床上不易与其他非典型肺炎相区别。因此对Mp感染的诊断目前主要还是依靠实验室诊断进行鉴别。Mp感染的实验室诊断方法包括分离培养、血清学检测和PCR技术等。Mp的分离培养可客观反映Mp的存在,但由于Mp对培养条件要求苛刻,且做出判定需6～15 d,因此分离培养一般不用于Mp感染的临床诊断。血清学和分子生物学试验是Mp感染实验室诊断常用的方法。分子诊断方面的各式PCR、基因探针等敏感性和特异性虽高,但实验室条件要求非常严格,设备要求高不易推广,且极微量的污染都会造成非特异性扩增[1-4]。因此血清学检测仍然是目前最重要的诊断方法之一。

血清学检测较为常用的方法是明胶颗粒凝集法(PA)和酶联免疫吸附实验 (ELISA)。PA检测IgM、IgG和IgA总抗体。ELISA法操作简便、快速且可以将IgM与IgG抗体分开检测,可进一步提高诊断的正确率,适合于临床实验室作为Mp感染的常规检查。Mp感染临床症状出现后7～10 d,血清中可检出IgM,1个月达高峰,维持的时间较长,在感染第二个月才开始下降。IgG抗体较IgM上升较晚,感染后2周IgG抗体达到可检出的水平,此后持续升高到症状出现后的第5周达到高峰,特异性的IgG抗体可维持1.5～2年[5],因此IgM 抗体的测定对急性期感染有特异的诊断价值。随着国家对医学诊断试剂销售的日益规范化,目前国内MP的检测主要采用进口试剂,以日本Serodia Myco II试剂盒(PA)使用最为广泛。这些试剂价格昂贵,使得一些不发达地区、基层单位无法开展Mp项目检测,势必会缩小Mp在呼吸道感染病原分析中所占的比率,还可能导致对呼吸道感染者滥用抗生素,是Mp耐药菌不断增加的原因之一。研发价廉且优质的国产试剂盒是当务之急。采用基因工程技术表达Mp重组蛋白是一种有效的途径可以方便地获得大量廉价的重组抗原,纯化后即可用于免疫学诊断。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 血清 疑似Mp感染血清标本由福建医科大学附属第一医院以及福建医科大学附属协和医院提供。健康成人献血者血清标本由宁德市中心血站提供。麻疹病毒、风疹病毒和出血热病毒感染阳性血清由福建省疾病预防控制中心保存。

1.1.2 试剂与仪器 大肠杆菌pET32a-2174-3176重组株为本室构建;菌株Mp FH株为本室保存菌株;羊抗人IgG-AP和IgM-H RP均为Southernbiotech公司产品,IgG/RF吸收剂为北京欧蒙医学诊断技术有限公司产品。样品稀释液、酶稀释液以及显色液由厦门英科新创公司提供。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒的诱导表达 接种含重组质粒pET32a-2174-3176的 BL21(DE3)单菌落于5mL LB(含氨苄青霉素 100 μ g/mL)液体培养基中,37℃250r/min振荡培养过夜,次日以1∶100的比例转种50mL LB液体培养基(含氨苄青霉素 100 μ g/mL)中,37℃250r/min振荡培养至 A600=0.6左右,加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L,继续培养3～4h,于4℃8000r/min离心10min收集菌体。10%SDS-PAGE检测表达产物,凝胶经考马斯亮蓝染色后观察蛋白表达情况。

1.2.2 Western blot鉴定重组蛋白的抗原活性常规方法将SDS-PAGE凝胶上的蛋白带转印到硝酸纤维素膜,转印膜加入适量封闭液室温温育2h,用肺炎支原体感染者的阳性血清与转印膜杂交,洗膜后加入1∶3 000羊抗人IgG-AP,室温温育1 h,洗膜后用BCIP/NBT系统显色。室温显色至蛋白带清晰后用蒸馏水终止反应。

1.2.3 重组蛋白的纯化 将收集的菌体用30mLBufferⅠ(5 mmol/L EDTA,20 mmol/L T ris.Cl,150 mmol/L NaCl,调pH 值至7.2)悬起,置冰浴上,80%强度的超声进行碎菌(相关参数为:功率350 W,总时间20 min,2 s超声,5 s间隔)。4℃12 000 r/min离心10min,弃上清。沉淀用10 mL的BufferⅠ重新悬起,加10 mL 4%Triton悬浮,4℃过夜后37℃作用30 min,4℃12 000r/min离心10min,弃上清。沉淀依次用2 mmol/L、4 mmol/L、8 mmol/L尿素洗涤,取8 mmol/L尿素洗涤上清进行10%SDS-PAGE电泳 ,CuCl2染色确定目标蛋白位置,将含目标蛋白的凝胶切出,置于装有1×Tris-甘氨酸缓冲液的透析袋进行电洗脱,2 h/次,共2次。洗脱液进行SDS-PAGE分析,鉴定其纯度并测定蛋白浓度。

1.2.4 间接ELISA检测患者血清中Mp IgM抗体①采用棋盘滴定法确定抗原的包被浓度及抗体的稀释度。即将重组抗原分别用包被缓冲液进行1∶10、1∶20、1 ∶40、1∶80、1∶320、1∶640 稀释 ;取经吸收的强阳性血清1份(PA试验血清效价达1∶640)及正常血清 1份用样本稀释液分别进行1∶10、1∶20、1∶40、1∶100、1∶200稀释,选择强阳性参考血清OD与阴性参考血清OD值的比值较大,而包被抗原稀释度较低的稀释度作为最适工作浓度。②以每孔100μL确定的抗原最佳工作浓度包被96孔酶标板,37℃放置2h,4℃过夜。③用PBST(PBS中含0.05%吐温-20)洗涤包被的酶标板3次。每孔加入封闭液(2%明胶,0.5%酪蛋白溶于PBS)200μL,37℃作用2h。④待检血清用 IgG/RF吸收剂以1∶10进行吸收,室温(18℃～25℃)温育30 min。再用样品稀释液稀释,100μL/孔加到酶标板中,并设阳性、阴性及空白对照孔,37℃作用30 min。⑤PBST洗涤3次。⑥用酶稀释液将羊抗人IgM-HRP按1∶5 000稀释,100μL/孔加到酶标板中,37℃孵育30min。⑦PBST洗涤3次。⑧每孔加显色剂A 液与B液各50μL,RT 10 min,用2mol/L H2SO450μL终止反应。在酶标仪上以波长450 nm读取OD值。

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1.2.5 Mp IgM阴性血清的判定 使用日本富士肺炎支原体抗体检测试剂盒SERODIA@-MYCOⅡ(PA法)对120份健康献血者血清进行检测。滴度＜1∶40的样本再用EUROIMMUN抗肺炎支原体抗体IgM检测试剂盒检测,再次检测为阴性的样本可认为Mp IgM阴性。

1.2.6 间接ELISA法临界值的确定 将上述肺炎支原体IgM抗体阴性的血清在最适反应条件下,按间接ELISA程序进行IgM抗体测定,结果进行统计学分析,计算血清的平均值(,标准差 s,临界值的计算公式为(±3s)。

1.2.7 交叉试验 以重组抗原包被酶标板,运用建立的ELISA方法检测麻疹病毒、风疹病毒和出血热病毒阳性血清,按间接 ELISA程序进行测定OD值,观察间接ELISA的特异性。

1.2.8 与商品化的检测试剂盒对比实验 用本实验建立的间接ELISA方法、EUROIMMUN ELISA(IgM)检测试剂盒以及SERODIA@-MYCOⅡ检测试剂盒在相同条件下对232份疑似Mp感染者血清样品进行检测。

2 结 果

2.1 重组蛋白表达和活性检测 重组质粒pET32a-2174-3176以 E.coli BL21(DE3)为宿主菌,经IPTG诱导后,将菌体蛋白进行SDS-PAGE,与未经诱导pET32a-2174-3176/BL21(DE3)的对照菌比较,可以清楚地看到诱导菌在44.3～66.4 kDa之间有一条明显的表达带出现,与预期56.8 kDa大小的分子量相符,重组蛋白在诱导前、诱导后1h及4h,表达量在不断提高,见图1。重组蛋白的免疫印迹显示,特异的蛋白带能与肺炎支原体感染者血清反应,而不含载体的细菌、只含空载体的细菌的相应位置均未出现此带,说明表达的该重组抗原具有免疫反应性(图2)。

2.2 重组蛋白的纯化 重组蛋白经电洗脱法纯化后,SDS-PAGE电泳呈单一条带,表明纯度高。结果如图3。纯化后测定蛋白含量,第一次洗涤重组蛋白浓度为0.86mg/mL、第二次洗涤重组蛋白浓度为0.44mg/mL。

图1 SDS-PAGE分析表达蛋白Fig.1 SDS-PAGE analysis of expression of pET32a-2174-3176 in E.coli BL21(DE3)

2.3 最佳浓度的确定 经棋盘滴定结果显示重组蛋白的最适包被浓度为21.5μ g/mL,最佳血清稀释浓度为1∶100。结果见表1。

2.4 肺炎支原体阴性样本的确定 使用PA方法对120份健康献血者血清进行检测,有98份PA滴度＜1∶40,这98份样本再用 EUROIMMUN抗肺炎支原体抗体IgM检测试剂盒检测,有82份样本为IgM抗体阴性样本,即可认为82份样本为肺炎支原体阴性。

2.5 临界值确定 将上述肺炎支原体抗体阴性的血清在最适反应条件下,按优化的间接ELISA程序进行IgM抗体测定,计算82份血清的平均OD值,结果进行统计学分析。82份 IgM抗体血清OD450值测定结果,OD450平均值为0.136,标准差为0.059。即OD450≥0.185为阳性,OD450＜0.185判定为阴性。确定判定标准为:P/N≥2.1,OD450≥0.185为阳性。见表2。

2.6 交叉反应试验 检测风疹病毒、麻疹病毒以及出血热病毒阳性血清各5份,均无交叉反应。

2.7 与商品化的检测试剂盒对比实验 用重组蛋白间接ELISA法和EUROIMMUN抗肺炎支原体抗体IgM检测试剂盒在相同条件下对232份样品进行检测。EUROIMMUN试剂盒在结果判定时有8份样本判定为可疑,需于7 d以后再次采集样本。因无法进行第二次血样的采集,这8份样品不纳入统计分析。经统计两种方法的符合率为89.29%,χ2=1.043(P＞0.05),利用重组蛋白和EUROIMMUN检出率的差异性无统计意义,以EUROIMMUN为参照标准,重组蛋白的敏感性为94.27%,特异性为77.61%,结果见表3。PA检测的结果有93份样本滴度≥1∶320,25份滴度＜1∶40。将这118份样本的EUROIMMUN和重组抗原ELISA方法的检测结果分别同PA法结果进行比较。以PA结果为参照标准,经统计分析,EUROIMMUN与PA方法的符合率为86.44%,EUROIMMUN方法的敏感性为 89.25%,特异性为76%,结果见表4。重组蛋白与PA方法的符合率为94.07%,重组蛋白的敏感性为96.78%,特异性为 84%,结果见表5。

表1 抗原最适包被浓度及血清最佳稀释度的确定Table 1 Determination of the optimal antigen dilutions and serumdilutions

表2 临界值的确定Table 2 Determination for the cutoff

表3 EUROIMMUN和重组蛋白ELISA检测疑似Mp感染者血清结果的比较Table 3 Comparison of detecting serum from suspected Mp infections by EUROIMMUNand recombinant proteins ELISA

表4 EUROIMMUN ELISA和PA检测疑似Mp感染者血清结果的比较Table 4 Comparison of detecting serum from suspected Mp infections by EUROIMMUN ELISA and PA method

表5 PA和和重组蛋白ELISA检测疑似Mp感染者血清结果的比较Table 5 Comparison of detecting serum from suspected Mp infections by PA method and recombinant proteins ELISA

3 讨 论

从蛋白表达产物的形式来看,我们构建的原核重组表达质粒所表达的蛋白是以包涵体形式存在,经免疫印迹确认,该重组蛋白具有强烈的反应原性,说明表达产物有作为诊断抗原的潜力。

应用表达蛋白建立间接ELISA方法时,在待检血清被稀释之前,先使用IgG/RF吸附剂进行免疫吸附反应。因为间接ELISA法检测IgM抗体的关键是必须去除患者血清中的IgG抗体,以防止IgM型类风湿因子与特异性IgG抗体反应而产生IgM抗体的假阳性,也可避免检测患者血清中的IgM抗体之前特异性IgG抗体替代IgM抗体与抗原结合,从而产生IgM抗体的假阴性结果。

评估一个新建立实验方法的敏感性,需要确诊为Mp感染的阳性血清,即需要一个金标准来判定标本是否为真阳性,但Mp感染却缺乏判定金标准。因此怎样确定真阳性一直是个悬而未决的问题。有人建议用培养或PCR的方法作为病原体存在的证据,但本研究均未采用。一方面是因为我们的样本均为临床常规检测后的留样,培养或PCR法都不是临床常规的检测方法,因此没法获得用来培养或做PCR用的临床标本。其次,就培养和PCR两种方法学而言,分离培养耗时且培养阳性率不高;PCR检测的是病原体,而不是机体的免疫应答。因此我们选择将建立的间接ELISA法同我省较常使用的两种进口商品化试剂盒进行比对,即以其中一种商品化试剂盒作为评价标准来评估我们建立的间接ELISA方法的敏感性和特异性。目前在我国血清学检测Mp感染仅有SERODIA@-MYCOⅡ检测试剂盒(PA法)获得注册证,因而,可以认为PA法的结果是较为可靠的。PA法测定Mp抗体是以明胶颗粒为载体,用Mp细胞膜成分来致敏的,因而具有较高的敏感性。用ELISA测定IgA、ELISA测定IgG结果和PA滴度存在差异,表明被动凝集法主要反映的是IgM经典抗体[6]。但PA试剂盒cutoff值的确定却存在争议,因为低水平的抗体滴度可能是既往感染产生的抗体,也可能是新近感染产生的抗体。研究表明以PA滴度≥1∶160为cutoff值,仍存在非特异反应,而要较准确判定 Mp感染,以PA滴度≥1∶320作为cutoff值为佳[7],因此我们将PA滴度≥1∶320,视为Mp IgM抗体阳性。但在Mp阴性血清界定的过程中,我们还是采用试剂盒推荐的1∶40作为cutoff值,将PA检测结果为阴性的样本用EUROIMMUN试剂盒再次筛检,再次筛检结果为阴性的样本我们判为该血清Mp IgM抗体阴性,这种联合检测有利于提高阴性血清判定的特异性。

本研究建立的间接ELISA法结果显示,如以EUROIMMUN ELISA试剂盒诊断结果为标准,本方法的敏感性为94.27%,特异性仅为77.61%。如以PA法诊断结果为标准,本方法的敏感性为94.07%,特异性可达84%,而EUROIMMUN方法的敏感性为89.25%,特异性为76%,且重组蛋白间接ELISA法与PA法的符合率要高于EUROIMMUN法。上述实验结果表明本研究建立的诊断方法具有良好的特异性和敏感性,为进一步开发商品化试剂盒奠定了基础。但此次临床血清学试验结果只是初步的,检测血清份数较少,尤其是缺乏Mp感染急性期和恢复期双份血清的验证,要成为商品化试剂还有许多工作要做。

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