日本血吸虫感染鼠巨噬细胞IL-13Rα 2的表达*

王 维,郑胜生,祁 瑶,闻惠琴,刘丽丽,沈继龙

IL-13细胞因子主要由活化 Th2细胞分泌[1],其功能具有多效性,IL-13表达异常与抗感染、肿瘤生长、哮喘发作、炎性损伤及组织修复等密切相关。作为Th2优势应答重要调节因子,IL-13已成为哮喘、特发性肺纤维化、溃疡性结肠炎等疾病重要治疗靶标。IL-13有亲合力和功能截然不同的二种受体:IL-13Rα 1和IL-13Rα 2,后二者氨基酸序列37%同源性。单独 IL-13Rα 1呈IL-13低亲合力;当 IL-13Rα 1与IL-4α结合形成异二聚体,则形成高亲合力的功能受体,促使IL-13发挥生物学效应[2]。相反,IL-13Rα 2与 IL-13的结合能力是 IL-13Rα 1的50倍,由于胞浆区仅含17个氨基酸,无结合JAK/STAT模序,不能启动IL-13-STAT6纤维化信号通路,从而行使“诱骗”IL-13作用,故 IL-13Rα 2又称“诱骗受体(decoy receptor)”[3-4]。

近年有关IL-13Rα 2在曼氏血吸虫病、哮喘等Th2免疫相关疾病中的作用已引起广泛关注。Mentink等报道曼氏血吸虫感染机体(患者和模型动物)血清IL-13Rα 2蛋白水平升高,且与肉芽肿体积相一致,IL-13Rα 2具有下调血吸虫病肉芽肿炎症反应,延长感染鼠寿命等作用[5]。鉴于Th2细胞因子必须通过细胞膜上受体传递信号级连,而关于血吸虫病IL-13Rα 2的细胞起源尚不清楚,本研究以感染日本血吸虫BALB/c鼠为模型,利用免疫荧光染色技术,检测肝肉芽肿和原代巨噬细胞IL-13Rα 2蛋白的表达情况,为进一步探讨血吸虫病等Th2型免疫疾病分子病理机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物与钉螺 5～6周龄BALB/c鼠购自中国科技大学实验动物中心。阳性钉螺购自无锡江苏省血吸虫病防治研究所。

1.2 主要试剂与仪器 胎牛血清(HyClone)、RPMI1640(Gibco)、多克隆羊抗鼠 IL-13Rα 2 IgG(R&D)、鼠抗CD68单克隆抗体(ED1,AbD Serotec)、羊抗鼠IgG(Jakson)、Cy3标记驴抗羊 IgG和FITC标记兔抗小鼠IgG抗体(Sigma);荧光显微镜(Nikon80i)、激光共聚焦显微镜(Leica TCS sp5)、细胞培养箱(BioTech)、超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)。

1.3 血吸虫病模型鼠的建立 雌、雄健康BALB/c鼠各30只,随机分成感染组和对照组。感染组鼠:活尾蚴25±2条经腹部皮肤攻击;对照组鼠:不予攻击。清洁级饲养,实验流程和小鼠处理过程遵循实验动物管理规范条例。

1.4 肝组织免疫组化染色 获取感染8周鼠肝脏,常规制片、脱腊,PBS洗涤;柠檬酸缓冲液抗原修复后;滴加5%羊血清,37℃恒温水箱孵育30min,加入羊抗鼠 IL-13Rα 2抗体(1∶200),4℃过夜;次日,滴加Cy3标记驴抗羊IgG(1∶500),室温1h,洗涤;滴加4,6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色细胞核(50μ g/mL),室温避光显色5min,甘油覆盖封片,荧光镜下观察、拍照及软件分析。对照组一抗用羊抗鼠IgG(1∶200)。

1.5 原代巨噬细胞分离、培养 于感染8周时,眼球放血、颈椎脱臼处死小鼠,75%乙醇浸泡消毒后,置超净台无菌条件下每只鼠腹腔注射冰0.01mol/L PBS 5 mL,轻揉腹部,收集灌洗液,250g×10min,弃上清;收集沉淀细胞,用含青、链霉素10%FCS/RPMI1640完全培养液重悬之,细胞计数并调整为1×106/mL单细胞悬液;多聚赖氨酸包被及贴壁法纯化细胞:24孔细胞培养板每孔预先滴加0.1%多聚赖氨酸0.2mL,半小时后去除多聚赖氨酸、晾干、待用。滴加1mL单细胞悬液/孔,置培养箱中培养,2h后换液并弃除未贴壁细胞,每孔再补加完全培养液、继续培养,每天倒置显微镜下观察细胞生长状态;第5d取出培养板,部分细胞用于鉴定,其余细胞用于以下实验。

1.6 细胞免疫荧光染色 取出第5d培养板,PBS轻微震荡洗涤5min×2次;每孔加入4%多聚甲醛0.5mL,4℃30min,同上洗涤;0.1%BSA/0.1%皂素/PBS 4℃封闭1h,洗涤;滴加一抗:羊抗鼠 IL-13Rα 2 IgG(1∶200)和抗 CD68单克隆抗体 (1∶100),4℃过夜;次日洗涤后,滴加相应荧光二抗:Cy3标记驴抗羊IgG(1∶500)和FITC标记兔抗小鼠 IgG(1∶200),室温孵育1h,洗涤;加入DAPI对照组一抗用羊抗鼠IgG。

1.7 结果分析 选择激发波长为330nm,发射波长为 420nm;激发波长为 490nm,发射波长为520nm;激发波长为510nm,发射波长为575nm的滤片,荧光显微镜下分别对 DAPI(蓝色)、Cy3(红色)、FITCI(绿色)荧光标记结果进行观察、拍摄图像,软件叠加获得组合图像。阳性标准:蓝色荧光观察细胞核(DAPI标记),红色荧光为 IL-13Rα 2(Cy3标记)反应信号,绿色荧光为ED1(FITCI标记)阳性反应,浅黄色荧光是叠加图像(绿色加红色)为CD68与IL-13Rα 2同一部位共表达的信号。

2 结 果

2.1 感染鼠肝肉芽肿表达IL-13Rα 2蛋白 肝组织切片荧光染色结果如图1A-C:椭圆形肉芽肿病灶与正常组织形成明显界线,虫卵位于中央,周围可见大量圆形或新月形兰色荧光即细胞核,图1A;观察同一视野下相应的IL-13Rα 2-Cy3染色,病灶内可见多个散在分布的红色“咖啡豆”,为特异性IL-13Rα 2抗体免疫反应阳性信号,图1B;二者叠加的图像显示,该阳性信号主要位于细胞浆,图1C,因此日本血吸虫病肉芽肿内存在IL-13Rα 2阳性表达的细胞。

2.2 巨噬细胞表达IL-13Rα 2蛋白

2.2.1 细胞鉴定 为证实巨噬细胞是IL-13Rα 2阳性表达的细胞,体外分离小鼠(感染8周)腹腔细胞,倒置显微镜下观察:12h部分细胞开始伸展、出现伪足;2d大部分细胞已伸展,呈星形、三角形,5d细胞生长状态如图2所示,正常鼠细胞数较少,图2A;感染鼠细胞数较多,图2B;光镜下感染组与对照组巨噬细胞形态、伸展、贴壁等无明显差异。细胞免疫荧光染色法结合激光共聚焦显微镜观察:全部细胞呈绿色荧光,表明贴壁法已获得高纯度巨噬细胞,图2C。

2.2.2 血吸虫病巨噬细胞增强表达IL-13Rα 2蛋白荧光镜下观察,血吸虫感染鼠腹腔巨噬细胞沿胞膜内缘可见一明亮红色环圈,图3A2;而正常对照鼠细胞同样部位未见明显的红色环圈,图3B2;阴性抗体对照组均未见红色荧光信号,图3C2,表明血吸虫感染诱导机体巨噬细胞增强表达IL-13Rα 2。

2.2.3 CD68与IL-13Rα 2细胞共表达 荧光镜下DAPI标记细胞核呈蓝色荧光(图3A1、B1、C1),正常和感染鼠巨噬细胞胞质均可见CD68阳性染色,图3A3、B3;感染鼠巨噬细胞胞质中可见明显IL-13Rα 2阳性染色(红色荧光),图3A2;组合图像呈浅黄色提示感染鼠IL-13Rα 2与CD68蛋白共表达,图3A4。

3 讨 论

诱骗受体 IL-13Rα 2基因结构高度保守,人、鼠序列同源性 59%,鼠 IL-13Rα 2 ORF 1 149bp,编码383个氨基酸,由胞外、跨膜和胞浆三个部分组成。IL-13Rα 2具有N端纤维连接蛋白样区域,4个保守的半胱氨酸残基,其胞外区含有促红细胞生成素受体家族保守模序WSXWS[2]。IL-13Rα 2蛋白有三种存在形式:外分泌型蛋白sIL-13Rα 2(soluble IL-13 receptor alpha 2)分子量45kD～50kD[6],以可溶性形式存在于血、尿中;膜结合型蛋白位于细胞膜上;胞浆型蛋白分布细胞质中,为主要存在形式。可溶性 sIL-13Rα 2-Fc(soluble IL-13 receptor alpha 2-Fc)蛋白可通过基因重组等技术获得,已成为IL-13高亲和力拮抗剂用于IL-13活性干预及其生物学效应等研究[7]。诱骗受体IL-13Rα 2虽能强力结合IL-13,但不能传导信号,已成为研究感染免疫、肿瘤等“热点分子”。IL-13Rα 2基因敲除鼠(IL-13Rα 2-deficient mice,IL-13Rα 2-/-)感染曼氏血吸虫后肝纤维化程度加重,给予注射sIL-13Rα 2-Fc后可得到改善,表明纤维化程度与IL-13活性增高有关[8]。更有意义的是,对某些高表达IL-13受体的肿瘤细胞,利用拮抗剂sIL-13Rα 2的受体定点靶向作用,实现对肿瘤细胞的特异性“杀死”,目前IL-13Rα 2肿瘤基因治疗已进入临床前期实验[9]。

鼠血吸虫病已成为Th2型免疫疾病研究的理想模型,在 IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等多种 Th2 细胞因子中,IL-13是最重要的介质[4,10]。巨噬细胞作为肉芽肿重要组成细胞,约占总数25%～30%[11],是机体与虫卵抗原最先直接接触的细胞[12],也是产生Th2应答所必须的条件[13]。电镜观察发现肝肉芽肿内巨噬细胞发生一系列超微结构的变化,感染6周的胞浆内出现大吞噬体,提示吞噬活动增强;感染8周粗面内质网增加,表明其蛋白合成能力增强[14]。

目前有关血吸虫和IL-13Rα 2的研究主要见于曼氏血吸虫病,日本血吸虫病和IL-13Rα 2的相关文献报道少见,然而日本血吸虫病肉芽肿等病理损伤较曼氏血吸虫病更为严重。此前我们已报道,日本血吸虫感染诱导机体IL-13Rα 2基因转录增强和血清IL-13Rα 2水平升高[15]。CD68是110kD的Ⅰ型跨膜糖蛋白,主要位于胞质,为巨噬细胞特征标志蛋白[16]。本研究采用免疫荧光标记技术,原位显示肝肉芽肿和原代巨噬细胞IL-13Rα 2基因表达产物,DAPI染色显示细胞核,再通过叠加的图像检测该蛋白亚细胞分布情况。该研究的结果表明,血吸虫病肝肉芽肿IL-13Rα 2蛋白异常增高,巨噬细胞是IL-13Rα 2阳性表达细胞。关于血吸虫感染诱导巨噬细胞增强表达诱骗受体IL-13Rα 2及其对炎性肉芽肿免疫病理调节作用有待后续研究。

图3 三重免疫荧光标记法检测血吸虫病巨噬细胞CD68/IL-13Rα 2蛋白(×400)Fig.3 Tristain immunofluorescence on the detection of CD68/IL-13Rα 2 protein(×400)

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