家畜戊型肝炎病毒诊断方法的建立及应用＊

苏乾莲，李 斌，赵 武，秦毅斌，梁家幸，肖爱欢，段群棚，何 颖，黄伟坚

2.广西大学动物科学技术学院，南宁 530005；

戊型肝炎（Hepatitis E，HE）是由戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus，HEV）引起的一种经消化道传播的急性病毒性肝炎，呈全球分布，以暴发流行或散发感染的形式存在。其临床和流行病学特点类似甲型肝炎，但主要侵犯青壮年，孕妇感染后病死率可高达20%［1］。1997年，Meng等在美国猪体首次分离到HEV毒株，发现其与美国人源HEV高度相似，并发现其可感染黑猩猩和恒河猴，从而首次证实了HEV种间传播的可能性［2］。随后，陆续在狗、猫、羊、牛、马等与人类密切相关的动物中发现HEV抗体或 RNA，但仍需要进一步深入研究［3－8］。

2007年第12届国际病毒性肝炎和肝病研讨会上，将HEV分为5个基因型，I型和II型仅感染人，III型和IV型为人兽共患，禽HEV被归为戊型肝炎病毒属，暂定为基因V型［9］。在前人研究基础上，本研究建立检测家畜基因I型－IV型HEV通用性RT－nPCR，并对采自广西各地的猪、牛、羊肝粪样本进行HEV检测。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 TRIZOL Regent为Invitrogen产；d NTP为上海生工生物工程有限公司产；Ribonuclease Inhibitor为 Ta KaRa产；M－MLV Reverse Transcriptase为 Promega产；Dream TaqTMDNA Polymerase为Fermentas产；Mark1为广州东盛生物科技有限公司产。

1.2 样本和对照品 采集广西地区猪、牛、羊新鲜粪便样本以及各地市场销售或屠宰场新鲜家畜肝脏，尽快检测或－20℃保存备检。戊型肝炎病毒阳性样本由广西大学赠送；猪瘟病毒（CSFV）、伪狂犬病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）、乙脑病毒（JEV）由本实验室保存；阴性对照为DEPC水。

1.3 引物设计及合成 参考GenBank上4种基因型HEV核苷酸序列，应用生物软件Oligo6.0在ORF2保守区设计两对简并引物，外套引物为：HEV－A/B，内套引物为：HEV－C/D，扩增片段长为436 bp，引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列如下：HEV－A：5’－TAYCGHAAYCAAGGHTGGCG－3’； HEV－B：5’－TGYTGGTTRTCRTARTCCTG－3’；HEV－C：5’－ATWCATGGVTCRCCTGTGAA－3’；HEV－D：5’－TRTCCTGCTGMGCRTTCTC－3’。

1.4 样本的处理 挑取0.4g新鲜粪便样本于5 m L离心管内，加入4m L灭菌 PBS（0.01 mol/L，p H7.2）进行稀释，旋涡震荡混匀，制备成10%的粪便悬液，4℃，10 000 r/min离心10 min，抽取上清进行RNA抽提或－20℃保存。取肝脏2.0 g于无菌研钵，研磨并用PBS稀释成1∶5乳剂，反复冻融3次后10 000 r/min离心1 0min，取上清进行RNA抽提或于－20℃保存备用。

1.5 病毒RNA的提取 取样本上清液250μL于1.5 m L的EP管（DEPC水处理，高压灭菌），加入800μL Trizol，反复颠倒数次充分混匀后，室温放置10 min；加入210μL氯仿，反复颠倒数次充分混匀（成乳白色为止），室温下放置3 min；4℃，12 000 r/min离心10 min后，小心取350μL上层液体，转移到一个新的EP管，再加入等量预冷异丙醇（350 μL），温和混匀，室温下放置10 min；4℃，12 000 r/min离心10 min后，弃去上清，加入500μL 75%预冷酒精，温和混匀，8 000 r/min离心5 min；将抽提RNA置50℃温箱内晾干（管壁上水滴消失即可）后，加入35μL无RNase的水，用移液器反复温和吹匀，并于50℃水浴5 min至RNA充分溶解；即用或－70℃保存备用。

1.6 反转录和PCR反应 本实验的反转录反应体系为25μL，其中 RNA 模板16μL，d NTP（10 mmol/L）混合物2μL，5×Buffer缓冲液5μL，MMLV Reverse Transcriptase（反转录酶）（200 U/μL）0.5μL，Rnasin Inhibitor（抑制剂）（40 U/μL）0.5μL，外套下游引物（25 mmol/L）1μL，各试剂混匀后42℃反转录1 h。PCR反应体系25μL，灭菌水17.75μL，10×PCR 缓 冲 液 2.5μL，d NTP（10mmol/L）混合物0.5μL，上下游引物（25 mmol/L）各0.5μL，Taq酶（5 U/μL）0.25μL，模板3μL。PCR反应条件：95℃预变性5 min；94℃变性1 min，53℃退火1 min，72℃延伸1 min，35个循环；最后72℃延伸10 min；第二次PCR进行30个循环，其它反应条件与首轮PCR反应条件相同。

1.7 特异性试验 提取阳性对照、对照样本和阴性对照的核酸，用建立的RT－nPCR方法进行检测，电泳观察结果。

1.8 敏感性试验与重复性检验 经紫外分光光度计测量阳性样本的核酸浓度，并做10倍梯度稀释至10－8，提取每个稀释度的RNA作模板分别进行RT－nPCR。对6份不同的阳性样本分别进行3次重复性试验，检验该方法的重复性和稳定性。

1.9 HEV RT－nPCR的临床应用 用建立的RT－nPCR方法对采自广西各地猪、牛、羊的905份粪便样本，272份肝脏样本进行HEV检测。

2 结 果

2.1 HEV RT－nPCR的特异性 只有HEV阳性样本在436 bp出现特异性条带，表明以HEV特异性引物不能检测出CSFV、PRV、PRRSV、PPV和JEV的核酸，显示RT－n PCR检测HEV具有良好特异性。

图1 HEV RT－nPCR的特异性检测M：Mark1；1：HEV阳性样本；2：阴性对照；3：猪瘟病毒；4：伪狂犬病毒；5：猪繁殖与呼吸综合征病毒；6：猪细小病毒；7：乙脑病毒Fig.1 Specificity evaluation of the RT－nPCR assay Land M：Mark1；1：HEV positive sample；2：negative control；3：CSFV；4：PRV；5：PRRSV；6：PPV；7：JEV

2.2 HEV RT－nPCR的敏感性与重复性 阳性样本的核酸浓度为30.30μg/m L，样本可检测到3.030 pg/μL。6份不同的阳性样本3次重复性检测均呈阳性，说明该方法具有良好的重复性和稳定性。

2.3 临床肝粪样本HEV的RT－nPCR检测 临床检测广西地区猪、牛、羊粪便样本阳性率31.49%（285/905），猪、牛、羊肝脏样本阳性率17.31%（49/272）。

3 讨 论

目前，HE的检测诊断最常用的是ELISA方法。血清学ELISA检测抗－HEV IgG显示广西部分地区存在多种动物 HEV的感染［10－11］。然而，目前家畜的HEV血清学ELISA抗体检测方法尚无标准化，而且血清成分较复杂，容易造成假阳性，同时已有报道在HEV血清学阴性的临床样本中检测到HEV RNA［12］。HEV通过粪便排毒所持续的时间要比病毒血症持续的时间长［13］，而且作为HEV主要病毒载体的粪便以及肝脏作为检测对象更容易检测到HEV核酸，因此家畜的HEV病原监测比血清学抗体监测更为确切。套式RT－PCR已经用于HEV的临床检测，目前较常用的引物有 Meng、ConORF1、ConORF2和E引物，本研究建立的RT－nPCR检测方法的引物主要针对基因I－IV型人畜HEV ORF2（其对于基因V型禽类HEV无法检测出，针对V型禽类HEV RT－nPCR检测方法的建立及应用另文刊发），该RT－nPCR具有良好的特异性、敏感性和重复性，前期应用表明具有良好的可行

性［14］。

广西是人HE的高发区，农村人群HEV抗体阳性率高达43%，而且亦已证实人感染HEV途径主要是通过接触猪及其排泄物而并非人与人之间接触传播［15］。广西农村人群HEV抗体阳性率较高可能与广大农村地区大都有将猪、牛、羊圈养在自己的屋子旁边的习惯，而且管理条件及卫生状况较差，易通过粪－口途径感染HEV具有密切关系。本研究通过对HEV主要载体粪肝的检测证实广西猪、牛、羊群存在HEV感染，进一步证实感染家畜及市售带毒家畜肝脏是HEV重要的储存库和传染源，应该重视其公共卫生学意义，预防粪－口途径或者食源性HEV感染。

［1］Skidmore S.Overview of hepatitis E virus［J］.Curr Infect Dis Rep，2002，4（2）：118－123.

［2］Meng XJ.Novel strains of hepatitis E virus identified from humans and other animal species：is hepatitis E a zoonosis［J］.J Hepatol，2000，33（5）：842－845.

［3］Li TC，Chijiwa K，Sera N，et al.Hepatitis E Virus Transmission from Wild Boar Meat［J］.Emerg Infect Dis，2005，11（12）：1958－1960.

［4］Okamoto H，Takahashi M，Nishizawa T，et al.Presence of Antibodies to Hepatitis E Virus in Japanese Pet Cats［J］.Infection，2004，32（1）：57－58.

［5］Saad MD，Hussein HA，Bashandy MM，et al.Hepatitis E virus Infection in Work Horses in Egypt［J］.Infect Genet Evol，2007，7（3）：368－373.

［6］Huang FF，Haqshenas G，Shivaprasad HL，et al.Heterogeneity and seroprevalence of a newly identified avian hepatitis E virus from chickens in the United States［J］.J Clin Microbiol，2002，40（11）：4197－4202.

［7］Tsarev SA，Tsareva TS.Experimental hepatitis E in pregnant rhesus monkeys：failure to transmit hepatitis E virus（HEV）to offspring and evidence of naturally acquired antibodies to HEV［J］.J Infect Dis，1995，172（1）：31－37.

［8］Guthmann JP，Klovstad H，Boccia D，et al.A Large Outbreak of Hepatitis E among a Displaced Population in Darfur，Sudan，2004：The Role of Water Treatment Methods［J］.Clin Infect Dis，2006，42（12）：1685－1691.

［9］Mushahwar IK.Hepatitis E Virus：molecular virology，clinical features，diagnosis，transmission，epidemiology，and prevention［J］.J Med Virol，2008，80（4）：646－658.

［10］韦献飞，梁靖瑞，唐荣兰，等.广西地区猪、鼠、狗戊型肝炎病毒感染血清学分析［J］.中国公共卫生，2007，23（2）：228－229.

［11］朱永红，陈焰锋，唐荣兰，等.猪、羊、鸡抗－H EV抗体流行率调查［J］.中华实验和临床病毒学杂志，2004，18（2）：127－128.

［12］李奎，庄辉，王佑春，等.从抗－HEV阴性的戊型肝炎病人血清中检测到l株 HEV变异株［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2000，20（2）：164－166.

［13］Clayson ET，Myin L KS，Snitbhan R，et al.Viremia，fecal shedding，and Ig M and Ig G responses in patients with hepatitis E ［J］.J Infect Dis，1995，172（4）：927－933.

［14］赵武，秦毅斌，肖爱欢，等.广西14市猪戊型肝炎的分子流行病学分析［J］.基因组学与应用生物学，2010，29（3）：464－470.

［15］Li RC，Ge SX，Li YP，et al.Seroprevalence of hepatitis E virus infection，rural southern people’s republic of China［J］.Emerging Infectious Diseases，2006，12（11）：1682－1688.