病理诊断中生物新技术的应用进展

杨学智，张芝莲

(阳煤集团总医院，山西阳泉 045000)

众所周知，病理诊断所应用的最早最经典的技术是光学显微镜技术。但随着生物医学的不断发展，光学显微镜技术的局限性逐渐显露，已不能完全满足临床病理诊断的要求。近几十年，随着分子生物学的飞速发展，带动了分子病理学相应技术的建立，为病理诊断的发展提供了新的途径［1］。现将几种生物新技术在病理诊断中的应用进展综述如下。

1 免疫组织化学

免疫组织化学是利用抗原抗体的特异性结合反应来检测和定位组织或细胞中的某种化学物质的一门技术。其特点不仅有较高的敏感性和特异性，还可以将形态学改变与功能、代谢变化结合起来，直接在各种切片上定位某种物质，并可结合电子计算机图像分析系统或激光扫描共聚焦显微术，对被检物定量分析。目前，该技术已广泛应用于临床病理，已成为病理诊断中不可或缺的诊断方法。尤其在肿瘤病理诊断中，协助低分化肿瘤、疑难肿瘤的诊断及淋巴瘤的分型中发挥了极其重要的作用。此外在细胞增殖和凋亡的研究、激素受体和耐药蛋白检测方面也具有重要价值［2，3］。但实际工作中，由于影响免疫组化染色质量的因素很多，可能造成判断的失误。因此，选择质量好的商品化抗体、严格技术操作和对照十分重要。

2 电子显微镜技术

由电子束和电子透镜组合成的电子光学系统可以将微小物体放大成像，极大地提高了分辨率。目前最好的电镜分辨率可达0.14 nm，有效放大倍数为100万倍。电镜可看清细胞膜和细胞质内的各种细胞器和细胞核的细微结构及其病理变化，并由此产生了亚细胞结构病理学［4］。电镜技术的应用领域很宽，在临床上可用于多种疾病亚细胞结构病变的观察和诊断，特别是肾小球疾病，以及一些疑难肿瘤的组织来源和细胞属性判定，如一些去分化、低分化或多向分化肿瘤的诊断和鉴别诊断。电镜技术也有其局限性，有时还可能遗漏信息，如当用于辅助肿瘤外检时，只能判定组织或细胞来源，不能确定肿瘤的良恶性质［5］。

3 原位多聚酶链式反应技术

原位PCR技术是将PCR的高效扩增与原位杂交的细胞及组织定位相结合，在冷冻或石蜡包埋组织切片、细胞涂片或培养细胞爬片上检测和定位核酸的技术［6］。该技术能用于低拷贝内源性基因的检测和定位，在完整的细胞样本上能检测出单一拷贝的DNA序列，可用于基因突变、基因重排和染色体易位等的研究和观察。还可用于外源性基因的检测和定位，如对各种感染性疾病病原(EB病毒、人乳头状瘤病毒、肝炎病毒、巨细胞病毒和人免疫缺陷病毒)的基因检测。在临床上还可用于对接受了基因治疗患者体内导入基因的检测等。然而，该技术目前还难于在国内大面积推广使用，主要是由于其特异性不高、技术操作复杂、需特殊设备、价格昂贵等。但随着技术的不断完善，原位PCR必将促使病理学新发展阶段的到来［7］。

4 激光扫描共聚焦显微技术

激光扫描共聚焦显微技术是近代生物医学图像分析仪器研究最重要的成就之一。它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，较传统显微镜有着不可比拟的优势［8，9］。利用激光扫描共聚焦显微技术可以在细胞原位用特异的荧光标记探针标记出核酸、蛋白质、多肽、酶、激素、磷脂、多糖、受体等分子，实现上述分子的定位、定性及定量检测，也可以观察细胞及亚细胞形态结构。激光扫描共聚焦显微技术不但可以对单标记或双标记细胞及组织标本的共聚焦荧光进行定量分析，还可以利用沿纵轴上移动标本进行多个光学切片的叠加形成组织或细胞中荧光标记结构的总体图像，以显示荧光在形态结构上的精确定位。因此，可以用于观察细胞、切片和一些表面不平的标本，同时可以做三维图像重建和标记强度的半定量分析。除上述功能，它还具有对活细胞长时间观察、细胞内酸碱度及细胞离子的定量测定、荧光漂白恢复等等功能。因此，在未来的几年内，激光扫描共聚焦显微技术将是包括病理学在内的医学研究中十分有效和有使用价值的主要研究仪器之一［10］。

5 显微切割术

显微切割术是20世纪90年代发展起来的一门新技术。切割的组织切片可以是冰冻或石蜡包埋组织切片或细胞涂片。它能从组织切片或细胞涂片上的任一区域内切割下几百个、几十个同类细胞，甚至单个细胞，再进行有关的分子生物学方面的研究，如PCR，PCR－SSCP及比较基因组杂交等。此后，在此基础上又发展起来激光捕获显微切割技术。它的基本原理是:将组织切片放在倒置显微镜的载物台上，并在切片表面覆盖一层乙烯乙酸乙烯酯(EVA)薄膜，激光束从上方垂直照射下来，光斑正好落在要切割的区域。该区的EVA膜受激光照射后，瞬间温度升高并与其下的细胞相粘连，但不损伤细胞;当将EVA膜揭起来时，与之相连的细胞也随之被完好地从切片上切割下来;将带有细胞的EVA膜放入试管内经蛋白酶消化使细胞与膜分开，同时也将细胞裂解，获得待提物质，如DNA，RNA或蛋白质。

显微切割术尤其适用于肿瘤的分子生物学研究，如肿瘤的克隆性分析、肿瘤发生和演变过程中各阶段细胞基因改变的比较研究和肿瘤细胞内某些酶活性的定量检测等。对显微切割下来的霍奇金淋巴瘤的肿瘤细胞的免疫球蛋白受体基因重排，研究证实其有非胚系重排，即有B淋巴细胞的克隆性增生。该技术的不足使手工操作的技术难度增大;用显微切割技术虽可克服上述不足，但需特殊设备，激光器造价又较高，还是限制了它的广泛使用。

6 生物芯片技术

生物芯片技术是近年才发展起来的生物医学高新技术系列，包括基因芯片、蛋白芯片和组织芯片。

基因芯片是固着在固相载体上的高密度DNA微点阵，又称DNA芯片。，由美国斯坦福大学医学中心生化系Brown教授领导的研究小组在1995年首先报道的。按功能可将其分为三类:即表达谱基因芯片、诊断芯片和检测芯片，前者主要用于基因功能的研究;后两者可用于遗传病、代谢病和某些肿瘤的诊断和病原微生物的检测等。利用基因芯片人们可以大规模、高通量地对成千上万个基因同时进行研究，从而解决了传统的核酸印记杂交技术操作复杂、自动化程度低、操作序列数量少和检测效率低等问题。通过设计不同的探针阵列和使用特定的分析方法使该技术具有广阔的应用前景［11］。

蛋白质芯片又称蛋白质微阵列，是对基因功能产物表达水平检测的技术。蛋白质芯片也是在一个载体上点布密度不同种类的蛋白质，再用荧光标记的已知抗体或配体与待测样本中的抗体或配体一起同芯片上蛋白质竞争结合，在扫描仪上读出荧光强弱，再经计算机分析计算出待测样本结果。随着蛋白质芯片制作技术的不断完善，检测容量已达13 000多个点，并实现了整个过程全自动化检测，具有高效率、低成本的特点，尤其适合于蛋白表达的大规模、多种类筛查，并能用于受体－配体、多种感染因素的筛查和肿瘤的诊断。

组织芯片是将数十个至数百个小的组织块整齐地排列在某一载体上而成的微缩组织切片。其特点是体积小、信息含量大，并可根据不同的需求进行组合并制成各种组织芯片，能高效、快速和低消耗地进行各种原位组织学的研究和观察，如形态学、免疫组织化学、原位杂交和原位PCR等，并有较好的内对照及试验条件的可比性［12］。

除上述技术外，其他一些近几年才发展起来的生物医学高新技术如流式细胞技术、比较基因组杂交等也在病理学中得到了应用，在此暂不赘述。这些新技术的发展和应用必将促进病理学诊断的进一步发展。

［1］ 查锡良，主编.医学分子生物学［M］.北京:人民卫生出版社，2003.

［2］ 武忠弼，主编.中华外科病理学［M］.北京:人民卫生出版社，2002.

［3］ 朱梅刚，主编.恶性淋巴瘤病理诊断学［M］.广州:广东科技出版社，2003.

［4］ 王晓民，姜志国，王德文.生物医学图像信息技术的应用和发展［J］.中国体视学与图像分析，2004，8(2):71-73.

［5］ 颜永碧，陆月良，王 英.电镜技术在病理学诊断中的应用［J］.第二军医大学学报，2003，6(24):628-649.

［6］ 苏 伟，索振河.原位PCR技术［J］.国外医学·遗传学分册，1996，19(2):64-66.

［7］ 李云家，宋运淳.原位PCR技术及其应用［J］.国外医学·分子生物学分册，1998，20(2):91-93.

［8］ Egger MD.The Development of Confocal Microscopy［J］.TINS，1989，12(1):11.

［9］ Huo Xia，Lu Jianxun，Yang Rendong，et al.Comparation of Laser Scanning Confocal Microscopy with Light Microsopy［J］.Acta Laser Biology Sinica，2001，10(1):76-79.

［10］ 李鹏云，曾晓荣.激光扫描共聚焦显微镜技术简介［J］.泸州医学院学报，2006 ，29(5):469-470.

［11］ 张建中.DNA芯片技术及其在病理学研究中的应用前景［J］.临床与试验病理学杂志，2000，16(2):324-325.

［12］ Kononen J，Bubendorf L，Kallioniemi A，et al.Tissue Microarrays for High-Throughout Molecular Profiling of Tumor Specimens［J］.Nat Med，1998，4(3):844-847.