猪胸膜放线杆菌中黏附素的研究进展

计 群,谢 芳,周 靓,王 瑜,杨舒心,李林溪,韩文瑜,雷连成

(吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春,130062)

胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)对猪肺上皮细胞的黏附是引发感染的第一步,是病原菌定植、生存和增殖的必要而又极其关键的过程。处于黏附状态的病原菌能够增强其对宿主的毒性作用,从而提高其对不利因素的抵抗力,并增强攫取营养的能力[2]。黏附素通常是位于 APP菌特定部位的一种蛋白,APP以这些黏附结构物质作为配体,与宿主细胞的表面受体相互作用,介导黏附作用的发生。为了与猪肺上皮细胞的特异性受体发生相互作用,黏附素必须被递呈至菌体表面。实验研究过程中可通过破碎菌体获得黏附素蛋白,通过研究其与猪肺上皮细胞的特定黏附作用探究疫苗开发的潜力。

1 自转运黏附素概述

APP属于革兰氏阴性菌,这类菌具有不同的蛋白分泌系统,而 V型分泌系统是其中最简单的分泌系统,经该系统分泌的多肽是通过位于外膜上的某个特定的转运蛋白而分泌的。当这两个多肽不同时分泌时,它们就构成了双伴侣分泌系统(Two-partner secretion system,TPs)。但当这两个多肽融合为一个蛋白时,就称为自转运蛋白(Autotransporter protein)[3]。目前,已发现的自转运蛋白有 700多种,它们是一类含有多种功能的家族蛋白,如黏附、侵入、蛋白水解活性、细胞毒性、血清抗性(Serum resistance)和细胞间播散(Cell-to-cell spread)等功能[4]。其中,自转运黏附素(Autotransporter adhesin)是近年来新发现的一种增强致病菌感染致病的重要毒力因子,引起了国外研究者的关注[5]。

研究发现,自转运黏附素分子结构与分泌过程的基因序列排布具有典型的特征。自转运黏附素的结构主要包含 N末端信号肽(Signal peptide)、中间的承载结构域(Passenger domain)和 C末端的转运单位(Translocation unit)。其中,承载结构域是决定自转运黏附素功能的区域[6]。其分泌的主要步骤是:第 1步,自转运黏附素通过 sec内膜分泌系统穿过内膜,此时 N末端信号肽被脱去;第 2步,转运单位形成 β折叠桶结构,插入外膜;第 3步,借助转运单位使承载结构域穿越到外膜外[6]。

2 自转运黏附素分类与结构

自转运黏附素分为 2种:传统的自转运黏附素(Conventional autotransporter adhesins)和近年来新发现的三聚体自转运黏附素(Trimeric autotransporteradhesins,TAAs)。传统的自转运黏附素的转运单位含大约 300个氨基酸,对其二级结构预测发现转运单位是由 12个 β折叠构成一个 β折叠桶,并且有一个α-螺旋将其与承载结构域隔开 。而 TAAs的转运单位非常短,大约 70个氨基酸,推测只有4个 β折叠。并且 TAAs是以三聚体的形式存在,因此功能性的转运单位也是由 12个 β折叠构成,它的每个单体由4个 β折叠组成。由于 TAAs的承载结构域也折叠成三聚体,这种自转运黏附素的亚家族被称为“三聚体”自转运黏附素。传统的自转运黏附素具有的一个明显的特征就是承载结构域 C末端的一段区域对于承载结构域的有效转运和折叠具有着重要的意义[7]。在转运时或转运后,此段区域扮演着分子内伴侣的角色,调节着承载结构域的折叠,因此这个区域被称为“自伴侣”[1]。三聚体自转运黏附素缺少这一“自伴侣”区域。研究者认为三聚体自转运黏附素不需要此区域,是由于承载结构域可以有效地启动折叠,可以发生自我折叠。此外,所有传统的自转运蛋白的承载结构域是从转运区域切割开的,以非共价形式结合在细菌表面或者直接释放到细胞外。近来的研究还认为,相对于传统的自转运黏附素,TAAs是以三聚体的形式与宿主细胞相互作用,具有更高的亲和力,这对于克服宿主的机械力并更稳定地黏附具有十分重要的作用。因此,TAAs更被认为是一种十分重要的毒力因子,具有潜在的研究应用价值。目前研究的 TAAs主要包括:小肠结肠炎耶尔森菌的 YadA;脑膜炎奈瑟菌的 NadA黏膜炎莫拉菌的UspA1和 A2;流感嗜血杆菌的 Hia和 Hsf;巴尔通体的 BadA[6]。

3 自转运黏附素功能及特征

自转运黏附素具有黏附作用,并且研究发现大多数自转运黏附素的受体与一种或多种细胞外基质蛋白有关,如胶原蛋白、纤维结合蛋白。然而,尚不能精确地确定自转运黏附素中负责黏附的结合区域,目前主要通过对黏附蛋白基因片段的酶切表达来探究其黏附部位,但一些承载结构域的基序已经证明与黏附素有关。例如,已经证实了含有 Arg-Gly-Asp(RGD)序列的承载结构域与黏附作用的发生密切相关。百日咳杆菌的自转运黏附素pertactin(Prn)含有RGD序列,并且在 Prn与上皮细胞的黏附中起着重要的作用[8]。其他的自转运黏附素也具有 RGD序列,如大肠杆菌的 Ag43和百日咳杆菌 BrkA。然而,由于许多自转运蛋白含有 RGD序列,但不具有黏附功能,因此 RGD序列是否具有黏附作用至今仍存在争议。此外,一些自转运黏附素含有重复氨基酸序列,这些序列可以代表结合位点。例如,富含脯氨酸的区域(PRR)经常出现在自转运黏附素中,如脑膜炎奈瑟(氏)菌的自转运黏附素 App含有 6个重复的Pro-Gin序列[9],Prn含有 5个重复的 Pro-GIn-Pro序列[10],立克次体的 rOMPA蛋白,含有 12个不完全重复序列,每个序列含有 70～75个氨基酸,这属于较长的重复序列[11]。三聚体自转运黏附素也发现含有大量重复序列。例如,YadA有 8个 Ser-Val-Ala-Ile-Gly-X-X-Ser重复序列[12]。相同位点的重复有利于同时与多个受体结合,或者一些相同的结合位点与同一受体分子结合,都可以提高自转运黏附素与受体结合的亲和力[13]。许多自转运黏附素还介导细菌自身凝集和生物膜形成,大多数情况下,这种现象的发生是由于两个临近细菌的承载结构域相互作用或者其中一个细菌的承载结构域与另一个细菌的其它表面蛋白相互作用。AIDA和 Ag43是大肠杆菌的自转运黏附素,高表达的大肠杆菌菌株具有显著的凝集现象,说明 AIDA和 Ag43可以相互作用,促进细菌凝集[14]。此外,许多自转运黏附素还具有其它活性,是多功能蛋白。有一些自转运黏附素表现出蛋白水解活性。很多时候,这种蛋白水解活性包括自转运黏附素自身水解的过程。如大肠杆菌的温度敏感型血凝素也具有血红蛋白酶解作用[15]。此外,自转运黏附素也表现出侵入性,或者可以结合宿主血清蛋白,起到抵抗血清杀菌活性和吞噬作用。近来还发现,黏膜炎莫拉菌的自转运黏附素 McaP不仅可以黏附上皮细胞,还具有酯酶和磷脂酶活性[16]。

4 自转运黏附素研究前景

自转运黏附素在细菌黏附宿主的过程中发挥主要作用,因此,通过研究黏附素蛋白与机体的免疫作用机制开发疫苗成为黏附素的重要应用方向。通过基因敲除方法去除特定的表达蛋白基因片段,研究特定的蛋白区域与细胞的结合状况来开发疫苗将成为一个好的应用途径。

随着对一些病原菌自转运黏附素的认识和深入研究,发现许多自转运黏附素具有免疫保护作用,有的还以自转运黏附素为主要成分成功开发出商品化疫苗。自转运蛋白作为一种疫苗使用的最成功的例子是自转运黏附素 pertactin。百日咳杆菌的自转运黏附素 pertactin(PRN)已经作为一种疫苗组分添加到商品化的五价无细胞百日咳疫苗中[17]。并且产生抗体水平较高的 pertactin是疫苗发挥作用、减低百日咳感染的最有效的因素。随后英国学者Mar在 2008年用百日咳杆菌的另一个自转运黏附素BrkA免疫小鼠,用强毒株攻毒,证实了 BrkA与自转运黏附素 pertactin具有相同的免疫保护作用 。非典型性流感嗜血杆菌(NTH1)的自转运黏附素 Hap和 Hia也是潜在的疫苗靶位。Hap的承载结构域具有免疫原性,免疫小鼠能获得较高的抗体效价并且具有免疫保护作用[19]。而 Hia不仅具有较高的免疫性,还具有调理吞噬作用,进一步说明 Hia可以作为防御 NTH1感染的有效疫苗[20]。此外,还在许多致病菌上发现自转运黏附素的免疫预防作用。如2009年,Daigneault等报道了溶血性曼氏杆菌分离株 A1的自转运黏附素 AhsA具有免疫性,并且 AhsA抗体可以抑制其黏附能力,是疫苗研究的候选靶位[21]。

5 展 望

自转运蛋白基因的序列多样性极大地丰富了自转运蛋白家族,使之成为革兰氏阴性菌的分泌蛋白中最大的家族。目前对自转运黏附素越来越多的研究表明,病原菌的自转运黏附素具有多种功能,包括黏附,聚集,生物膜形成和抗宿主防御,是病原菌重要的毒力因子。甚至一些自转运黏附素是免疫保护的关键靶位,有望成为防御细菌感染的新的疫苗候选。目前,国外研究者仅对少数病原菌的自转运黏附素在分子水平上进行了鉴定,并发现了其功能与毒性的关系。今后的研究应深入了解自转运黏附素家族与毒力相关的性质,并且阐明它们在宿主相互作用的地位。此外,对已经测序完成的革兰氏阴性菌的基因组的分析还发现,许多 ORFs的编码蛋白含有自转运蛋白区域。大部分这些假定的自转运蛋白并没有进行鉴定,是否具有黏附活性及其对宿主是否具有毒力有待于进一步研究,而自转运黏附素是否可以成为一种有效的预防疾病疫苗的新靶位也需要进一步确定。目前猪传染性胸膜肺炎的疫苗主要是弱毒苗、菌影疫苗、基因疫苗、传统灭活苗、异源疫苗,由于 APP交叉保护性很弱,所以这类疫苗有各自缺点。通过对 APP中黏附素结构的研究,着手于 APP粘附宿主的第一步,探究其作用机理和免疫源性,从而为疫苗的研制和开发提供基础和良好平台。

[1] 韩文瑜,谢芳,雷连成.病原菌自转运黏附素的研究进展[J].中国兽医学报,2010,30(4):560-564.

[2] SHOAF-SWEENEY K D,HUTKINS R W.Adherence,anti-adherence,and oligosaccharides preventing pathogens from sticking to the host[J].Adv Food Nutr Res,2009,55:101-161.

[3] DESVAUX M,PARHAM N J,HENDERSON IR.The autotransporter secretion system[J].Res Microbiol,2004,155:53-60.

[4] HENDERSON IR,NATARO JP.Virulence functions ofautotransporter proteins[J].Infect Immun,2001,69:1 231-1243.

[5] GIRARD V,MOUREZM.Adhesionmediated by autotransporters of Gram-negative bacteria:structural and functional features[J].ResMicrobiol,2006,157:407-416.

[6] LINKED,RIESS T,AUTENRIETH I B,etal.Trimeric autotransporter adhesins:variable structure,common function[J].TrendsMicrobiol,2006,14:264-270.

[7] OLIVER D C,HUANG G,NODEL E,et al.A conserved region within the Bordetella pertussis autotransporter BrkA is necessary for folding of its passenger domain[J].Mol Microbiol,2003,47:1 367-1 383.

[8] LEININGER E,ROBERTSM,KENIMER JG,etal.Pertactin,an Arg-Gly-Asp containing Bordetella pertussis surface protein that promotes adherence ofmammalian cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,1991,88:345-349.

[9] SERRUTOD,ADU-BOBIE J,SCARSELLIM,etal.Neisseriameningitidis App,a new adhesin with autocatalytic serine protease activity[J].MolMicrobiol,2003,48:323-334.

[10] EMSLEY P,CHARLES IG,FAIRWEATHER N F,et al.Structure of Bordetella pertussis virulence factor P.69 pertactin[J].Nature,1996,381:90-92.

[11] ANDERSON BE,MCDONALD G A,JONESD C,et al.A protective protein antigen of Rickettsia rickettsii has tandemly repeated,near-identical sequences[J].Infect Immun,1990,58:2 760-2 769.

[12] NUMMELIN H,MERCKELM C,LEO JC,etal.The Yersinia adhesin YadA collagen-binding domain structure is a novel left-handed parallel beta-roll[J].EMBO J,2004,23:701-711.

[13] COTTERS E,SURANA N K,STGEME JWⅢ.Trimeric autotransporters:a distinctsubfamily of autotransporter proteins[J].TrendsMicrobiol,2005,13:199-205.

[14] SHERLOCK O,SCHEMBRIM A,REISNER A,et al.Nove roles for the AIDA adhesin from diarrheagenic Escherichia coli:cell aggregation and biofilm formation[J].J Bacteriol,2004,186:8 058-8 065.

[15] OTTO BR,SIJHRANDIR,LUIRINK J,et al.Crystal struture ofhemoglobin protease,a heme binding autotransporter protein from pathogenic Escherichia coli[J].JBiol Chem,2005,280:17 339-l7 345.

[16] TIMPE JM,HOLM M,VANLERBERG SL,etal.Identification of a Moraxella catarrhalis outermembrane protein exhibiting both adhesin and lipolytic activities[J].Infect Immun,2003,71:1 341-1 350.

[17] JEFFERSON T,RUDIN M,DI PIETRANTONJC.Systematic review of the effects of pertussis vaccines in children[J].Vaccine,2003,21:2 003-2 014.

[18] MARR N,OLIVER D C,LAURENTV,etal.Protective activity of the Bordetella pertussis BrkA autotransporter in themurine lung colonizationmodel[J].Vaccine,2008,26:4 306-4 311.

[19] CUTTER D,MASON KW,HOWELL A P,et al.Immunization with Haemophilus influenzae Hap adhesin protects against nasopharyngeal colonization in experimentalmice[J].J Infect Dis,2002,186:1 115-1 121.

[20] WINTER LE,BARENKAMP SJ.Antibodies specific for the H ia adhesion proteins ofnontypeahle Haemophilus in fluenzae mediate opsonophagocytic activity[J].Clin Vaccine Immunol,2009,16:1 040-1 046.

[21] DAIGNEAUH M C,LOR Y.Analysis of a collagen-binding trimeric autotransporteradhesin from Mannheimia haemolytica A1[J].FEMSMicrobiol Lett,2009,300:242-248.

(责任编辑:石瑞珍)