李斯特菌检测技术研究进展

龙 川,吕亚楠,钱爱东,赵 权

(吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春,130118)

李斯特菌(Listeriamonocytogenes,LM)最早于 1924年由英国剑桥大学学者从实验室患败血症大鼠和兔子中分离得到[1]。该菌广泛存在于土壤、人和动物的粪便中,很容易污染食品而引起食物中毒和李斯特病暴发。该菌有着独一无二的生物学特征,它能在不同的环境条件下生长。例如,它可在 2～4℃下生长,在 -18℃可存活,甚至在反复冻融的条件下仍可存活。该菌最适宜的生长温度为 30～37℃,最高可忍受 44℃的高温[2]。由该菌引起的李斯特菌症能够使人和动物患脑膜炎、脑炎、败血症及造成怀孕妇女流产、死胎等疾病,且病死率很高。常规抗生素治疗疗效一般。2000年,李斯特杆菌病在法国向人类发起攻击。法国卫生部门 2010年报道,法国发现 9人因食用熟肉制品而感染了李斯特杆菌病,其中 2人已经死亡[3]。

食品中李斯特菌的传统检测方法是将分离纯培养后的可疑菌落进行生化反应、动物实验、典型运动等鉴定,被确定为李氏杆菌后进一步进行血清型分析[4]。传统的分离方法有FAD法、IDF法、USDA法、冷增菌法(CE)和快速分离程序(RAP-ID程序)。传统的检测方法病原的分离率低,耗时较长,敏感性较差。已经越来越不适应人们的生产发展了。

1 血清学检测方法

血清学检测具有实验设备简单,操作方便,实验结果较快的特点。很多病原菌用血清学手段都能达到快速的检测。最初利用血清学方法检测李氏杆菌的鞭毛抗体,但是本法特异性较差,不能鉴定复杂抗原群,因为本法在李氏杆菌症病史的动物血清中成阳性反应。Berche Patriek[5]以纯化的李斯特菌检测血清中抗李斯特菌抗体的Dot-blot法,以诊断是否有李斯特菌感染,效果不错,但存在假阳性。据报道,李氏杆菌与某些大肠杆菌有共同抗原,由于交叉反映普遍存在故很难利用血清学方法准确诊断。用酶免疫分析法(EIA)检测血清型 1和 4b“M”“O”和“H”抗原,结果与试管凝集试验相一致,但EIA的滴度高,而且需要的试剂比试管凝集试验少,应用光密度测定的结果较试管凝集试验更客观。

2 PCR方法检测李氏杆菌

随着分子生物学的迅猛发展,聚合酶链式反应(PCR)方法以其快速、简便、特异性高的特点,在生物学的各个领域发挥着越来越重要的作用。Paillard.D和 Fitter S根据限制性片段长度多态性的原理,用 PCR方法扩增出李斯特氏菌的23SrRNA的两段保守序列,并通过比较各扩增出来的限制性片段长度来检测李斯特氏菌,可达到区分李斯特氏菌不同种的水平[6,7]。依据李氏杆菌 hlyA基因序列设计引物,利用富集培养结合 PCR扩增的方法检测食品中的 LM,仅需要 24 h或 2 d。Wieckowska.M根据 hly基因建立 PCR法检测牛奶中的李斯特菌,检测灵敏度为 50 cfu/L。Cocolin[9]建立了 1种新的检测鉴定食品中 L.spp和LM的分子方法。用来自 5个种的iap(invasion associated protein)基因扩增片段和PCR产物的变性梯度胶电泳(DGGE),使 5个种容易得到快速分离和鉴定。近年来,实时荧光 PCR技术检测 LMO更快速、敏感、特异,同时能有效地克服食品基质、培养基成分和杂菌对常规 PCR检验的干扰作用[10]。

3 单克隆抗体法检测李氏杆菌

单克隆抗体这项技术一经问世就从根本上解决了在抗体制备中长期存在的特异性和可重复性问题。使抗体的规模性生产成为可能。人们尝试制作一种特异性单克隆抗体,能特异的和单核增生性李氏杆菌结合,用于食品的检测。目前根据不同抗原建立了很多检测方法。Butman在1988年报道了巧株李斯特氏菌属特异表位的单克隆抗体,用以上单抗构成的夹心 ELISA检测方法能于前增菌后24 h内报道检出结果,最低菌浓度检出为 5×108cfu/L[11]。焦新安[12]在 1994年应用 3株李斯特菌属特异单抗检测试剂,建立了快速检测李斯特菌的间接免疫荧光和夹心ELISA方法。蒋原等[13]运用淋巴细胞杂交瘤技术获得4株杂交瘤细胞可分泌抗李斯特菌属表位单抗的,特异性高,与其它菌无交叉反应。

4 仪器法检测单克隆抗体

全自动微生物分析系统是用仪器检测李氏杆菌的方法,首先用常规法筛选可疑菌落,然后用仪器鉴定,国内外现在已有很多全自动微生物分析系统,如BITEK-AMs系统、vitek系统、Midd系统、Biolog系统、Autosceptor系统等。国际分析化学协会(AOAC)把BITEK-AMS系统列为法定分析法。据报道用Vitek微生物自动分析仪进行李斯特菌鉴定,与传统方法相比,符合率 100%,仅需 7～14 h就能检测出结果,具有快速、准确等优点[14]。据美国农业部研究报告称,用“流式细胞仪”可 1次准确检测出 100个李氏杆菌样品,可更快速、方便、准确地检测李斯特菌。虽然仪器方法操作简便,准确率也很高,但仍有它的局限性,此种方法是建立在成熟实验人员筛选可疑菌落之上的。

5 讨 论

未来很长的一段时间内,李斯特菌病仍将是世界性的公共卫生问题。我国的李斯特菌症防制仍面临着巨大的挑战。客观技术条件的制约以及细菌病原的复杂性,李斯特菌的快速准确检测仍是困扰研究人员的一大难题。环境中李斯特菌的大量存在和李斯特菌症的高致死率,使实现快速准确检测成为亟待解决的问题之一。传统方法敏感性差,耗时长已不能适应时代变化。

新的生物技术手段的应用,为解决这一问题打开了另一扇大门。传统的蛋白层面的研究由于受复杂抗原性的影响,特异性较差。基因层面特别是荧光 PCR技术和核酸探针等技术的成熟,使研发一种快速准确的检测方法成为可能。国内外学者做出了很多尝试,取得了一定的成效。但由于受技术层面的影响不能普及。在我国如何因地制宜,多种检测手段综合利用,为李斯特菌病的预防和诊断做出有效的技术支持,是我国需要解决的问题。

[1] 吴清平,李善志,张菊梅,等.单核细胞增生李斯特杆菌检测技术研究进展[J].中国卫生检验杂志,2005(7):888-890.

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[3] 殷月兰,朱国强,耿士忠,等.单产核细胞李斯特菌 actA/plcB缺失株的构建及其生物学特性[J].微生物学报,2008,48(3):299-303.

[4] 梁锐萍,黄素珍,胡慧强.单核细胞增生性李斯特氏菌及其检验[J].动物科学与动物医学,2004,113(11):47-49.

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[6] PAILLARD D,DUBOISV,DURAN R,et al.RaPid identifieation of Listerias Peeies By using restrietion fragment length-Polymorphism of PCR Am Plified 235rRNA gene fragments[J].APPIEnviron Microbiol,2003,69(11):6 368-6 392.

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[9] COCOLIN L,RANTSIONK,IACUMIN L,et al.Derect identification in food samples of Listeria spp.and Listeriamonocytogenes bymolecularmethods[J].App lMicrobiol,2002,68(12):6 273-6 282.

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[11] BUTMAN B,PLANK M,DURHAM R,etal.Monoelonal antibodies which identify a genus～specific Listeria antigen[J].Appl Environ Microbiol,1988,54(6):1 564-1 569.

[12] 焦新安,刘秀梵,张如宽,等.李斯特菌属特异单抗试剂的研制及鉴定[J].中国畜禽传染病,1994,79(6):17-19.

[13] 蒋原,侯永达,马玉笙,等.李斯特氏菌属单克隆抗体的制备及其特性的研究[J].现代商检科技,1998,8(2):8-10.

[14] 封幼玲,戴建华,陈太基,等.食品中李斯特菌的污染状况调查及快速检验方法的研究[J].中国卫生检验杂志,

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(责任编辑:石瑞珍)