抗菌肽的研究进展

刁昱文,赵红蕾,高 宇,刘珊珊,冯 新,雷连成,韩文瑜

(吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春,130062)

自从青霉素发现以来,抗生素一直是人类治疗病原微生物感染的有力武器,但是由于人类对抗生素的持续使用和滥用,导致很多细菌和病毒对现有的抗生素都产生了耐药性。NDM-1超级细菌的出现,更是引起了世界对病菌耐药性问题的极大重视乃至恐慌[1]。欧洲专家预计,至少 10年内没有抗生素可以有效对付这种细菌,因此呼吁全球密切监控阻止超级细菌传播,更迫切的需要寻找具有全新机制杀伤病原微生物,且不易形成耐药性的新型微生物制剂。

1 抗菌肽概述

1950年在弗莱明发现青霉素的同时,在血细胞中首次发现了具有广谱抗菌活性物质的存在[2]。随后在巨噬细胞中发现了可以对感染发生作用的细胞内的阳离子抗菌肽,其作用与昆虫的先天免疫细胞相同[3,4]。1974年,瑞典科学家G.Boman等向眉纹天蚕蛾(Sam ia Cynthia)蛹注入大肠杆菌后,在血淋巴细胞中发现了一种具有抗菌活性的碱性多肽类物质,随后诱导惜古比天蚕(Hyalophra Cecropia)蛹也发现了类似的抗菌活性物质[5,6]。1981年,这种具有抗菌活性的物质被命名为 cecropin[7],这是人们第一次真正意义上发现抗菌肽。1983年 Lehrer和Selsted从兔的肺巨噬细胞中纯化出两种抗菌肽,随后被命名为defensins[8]。在随后的研究中,从哺乳动物、两栖类、鱼类、昆虫类、鸟类和植物中均发现了抗菌肽[9～13]。

抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是天然免疫系统的重要组成部分,其分子量小、热稳定性好、抗菌高效广谱,抗菌机理不同于抗生素,对真核细胞几乎没有作用,仅作用于原核细胞,同时不易使病原菌产生耐药性,而且对真菌、病毒、原虫和肿瘤细胞有一定杀伤作用,具备新型药物开发的巨大潜力[15～17],据最新统计,在线数据库中(http://aps.unmc.edu/AP/main.phe.)已有 2 000多种不同来源的抗菌肽被收录。

抗菌肽根据内部二级结构和氨基酸不同可分为α螺旋蛋白类、富含色氨酸的 AMPs、含有二硫键的 AMPs、富含脯氨酸的昆虫抗菌肽、Cationic peptide-antisense oligonucleotide Hybrids、阳离子多肽的抗菌拟肽、乳酸杆菌和链球菌产生的抗菌肽、多粘菌素[18～20]。

2 抗菌肽的主要研究热点及发展趋势

2.1 新型抗菌肽的发现与鉴别

发现并鉴定新型抗菌肽仍是国内外研究者所关注的热点。随着研究水平的不断提高,新型抗菌肽发现的速度与数量与日俱增。目前分离鉴定最直接的方法是通过给予待测生物特定的刺激或不刺激,收集分泌物,以蛋白纯化方法直接分离,通过质谱鉴定。将蛋白质组学和肽组学技术运用到抗菌肽的分离与鉴定,是获得新的抗菌肽的更为可取的方法。构建皮肤组织的 cDNA文库,结合特定的筛选策略,高通量的筛选特定种类的多肽全长的 cDNA编码序列,通过基因工程方法进行表达或人工合成来获得纯的抗菌肽进行生物学活性研究。

仅在 20世纪70～90年代,欧洲、美洲、非洲、澳洲的研究者们就对其本土的两栖类动物皮肤分泌液中的活性化学物质进行了大规模的调查研究和开发利用工作,发现了上百种的两栖类动物皮肤活性多肽。中国科学院昆明动物所的赖仞等从单个无指盘臭蛙克隆得到了 372条抗菌肽序列,他们编码 107条新的抗菌肽,分别属于 30个不同的抗菌肽家族。这一发现使得目前发现的两栖类抗菌肽数目增加了 2倍 。

2010年,Mechkarska等从去甲肾上腺素刺激负子蟾科非洲爪蛙的皮肤分泌物中,分离鉴定出 9种具有抗菌活性的抗菌肽,其中,1个多肽是 magainin-2的同源类似物,2个是 PGLa的同源类似物,1个雨蛙肽前体,1个爪蟾肽前体,4个 CPF等。研究显示对 Escherichia coli和 Staphylococcus aureus均有抑菌活性[22]。

本研究室以牛蛙皮肤中提取的mRNA为材料,构建牛蛙皮肤 cDNA文库。利用 PCR方法对文库进行筛选。发现 6个新抗菌肽序列,根据序列特征可分为 3个家族:Catesbeianin-1,Ranacyclin,Temporin。对新发现的抗菌肽进行了生物学活性测定,同时发现Temporin对革兰氏阳性菌有着很好的杀菌作用[23]。

2.2 抗菌肽的设计

抗菌肽分子设计是一个相当活跃的领域,多学科交叉在这里得到了充分体现。伴随每一种新抗菌肽的发现,都会进行氨基酸序列的修饰,目的是寻找对抗菌活性影响的关键部位,并进一步进行分子设计,以期最大限度提升抗菌肽的抗菌活性。对天然抗菌肽进行序列修饰包括以下内容,即增加、删除、或替代 1个或多个残基,截取肽链N端或C端部分序列,连接不同自然来源的抗菌肽片段成为杂合肽等。

2.2.1 靶向性抗菌肽的设计 在对抗菌肽的抗菌活性研究的同时,有研究者注意到,一些抗菌肽在治疗黏膜感染时,并不能对有益菌群和致病菌群进行选择性杀伤,有益菌群的破坏,很有可能导致二次感染。靶向性抗菌肽的设计,可以只对致病菌进行杀伤,从而维持正常菌群的生长。

Steven A等设计了一个含有固定环状抗菌肽,基于稳定的胱氨酸 β折叠股框架,这个框架模拟可能的 LPS结合位点,对革兰氏阴性细菌 E.coli在抗菌肽最低浓度 20 nmol/L时,有着有效的杀菌效果,选择效果高于革兰氏阳性细菌S.aureus 200倍[24]。

Eckert等通过化学合成法,将没有杀灭门多萨假单胞菌(Pseudomonasmendocina)能力的特异性靶向定位区域(KH)与广谱 AMP(novinspirin G10)融合,合成了能选择性地杀灭门多萨假单胞菌的G10KHc。G10KHc的靶向定位能力由KH分子与细菌的选择性结合引起,说明KH选择性地传递G 10KHc至门多萨假单胞菌表面后,AMP区域快速破坏外膜,增强穿透细胞质膜的能力引起细胞死亡[25]。

在 Eckert研究基础上,He等设计并合成了具有双靶点特意性的AMM8(KH)-20。体外实验表明,M8(KH)-20可以对门多萨假单胞菌和变异链球菌(Streptococcusmutans)有着特异性靶向杀灭作用,并对共同培养的其它非靶向病原菌的影响较小[26]。

2.2.2 生物信息序列分析 伴随着生物软件和相关网站的发展,运用生物信息学手段对抗菌肽进行结构分析、功能预测和新序列设计已经成为生物学与计算机科学交叉运用的热点。

将化学信息学、生物信息学和相关数据库联合应用,可以进行新型抗菌肽的发现与设计、抗菌肽的功能预测、方法分析,对在线搜索结果进行关联和对比,还可以进行构效关系分析。网站有http://www.expery.Org等,软件有 Accelrys公司的 Insight II三维图形环境软件包。免费软件:蛋白序列分析软件包ANTHEPROT,DNASTAR等包括了蛋白质研究领域所包括的大多数内容,功能非常强大,能进行各种蛋白序列分析与特性预测。

Sarah R等应用聚类分析的方法,对具有抗肿瘤活性的抗菌肽,按照静电荷数目,平均疏水力矩和平均疏水性 3个参数进行了聚类分析。经过分析得出,疏水性是抗菌肽进行穿膜的关键因素[27]。

孙雁霞等对 defensin抗菌肽进行了生物信息学分析。一级结构表明其具有典型的昆虫防御素特征。二级结构分析表明 defensin抗菌肽中主要的结构元件为α-螺旋。通过对不同物种 defensin抗菌肽的分析结果表明,非阳离子抗菌肽的作用机制可能是疏水作用力起主导作用,或者是与细菌胞内酶结构与功能、细菌胞内信号转导的影响有关[28]。

Tossi等自建的数据库广泛收集了 800多条抗菌肽,这些抗菌肽中基于不同的生物来源,能形成两亲α-螺旋的有 150多条。将其 N端 20个氨基酸残基根据不同类型(电性、极性、螺旋稳定性等)进行统计,得出了序列模板:ghhp+hxpxh+phh+xhhxh[29]。Tiozzo等以该序列模板为基础,设计出类似于哺乳动物中抗菌肽 cathelicidin家族的新型肽 PGY a(PGY a:G LLRRLRDF LKKIGEKFKKIGY-NH 2)[30]。在此基础上,G iangaspero等用这个模板研究物理化学参数对活性的影响,通过序列变化合成了 20条肽链,得到了一系列具有参考价值的结论,这在某种程度上对多样性抗菌序列进行了一个总结,为单独对个别肽链进行分子设计提供了参考[31]。

2.3 抗菌肽在先天性免疫中的作用

先天性免疫是提供给有机体对抗致病微生物侵袭的快速的第一道防线。由于抗菌肽可以对多种致病微生物快速发挥功能,所以宿主来源的抗菌肽一直被认为是机体的“天然抗生素”,其特点是来源多样,并且参与先天性免疫的各个环节而成为新的治疗药物的设计基础[14,32～33]。

Territo等[34]首次证明,α-defensins是人类单核细胞的趋化因子。Scott等[35]发现了可以选择性地调节先天性免疫反应的抗菌肽。Scott设计的13个氨基酸的非毒性多肽IDR-1(KSRIVPAIPVSLL-NH 2)可以减弱促炎症细胞因子的产生,同时促进单核细胞的选择性聚集,增强和维持单核巨噬细胞炎症趋化因子水平。

感染或损伤处所分泌的Cathelicidins和defensins对效应细胞具有趋化性,诱导化学激活素的转录及分泌和肥大细胞的组胺释放,这些反应共同促进先天的及获得性免疫细胞的补充。Cathelicidin家族的抗菌肽能够抑制致炎细胞因子如TNF-α,IFN-r和 IL-6的相关基因转录、促炎症反应物质的释放及避免细菌感染后啮齿类的脓毒症,还能防止引起组织损伤和炎症的毒性组分的产生,Cathelicidin家族抗菌肽还可通过调节TLR 4来调节炎症反应[36]。

2.4 抗菌肽药物的开发利用

2.4.1 抗菌肽在人类疾病和健康的临床应用 目前,人类医学上抗菌肽的研究主要针对皮肤疾病、呼吸性疾病、肠疾病等一些炎性疾病和由致病微生物所引起的感染性疾病。同时,抗菌肽的抗肿瘤活性也已经得到广泛的认可和关注。

在哺乳动物和人类中已经发现的抗菌肽在人体中主要起的两个作用已被证实,一是直接的杀菌特性,二是免疫调节特性。应用比较多的两种抗菌肽是Cathelicidin和 defensins,它们的抗菌活性和多向的在感染和炎症疾病中的免疫调节作用已被证实。通过具有针对性和系统性的路线进行刺激诱导性给药而激发内源性抗菌肽,是一种安全的成本低廉的治疗方案。同时还避免了合成类似物所产生的副作用和药物在体内靶向传递的困难[37]。

有研究者发现,在皮肤上Cathelicidin对A型链球菌有着明显的抗菌作用,但是在体外实验中对大肠杆菌 B型链球菌和金黄色葡萄球菌的抗菌能力有所降低[38]。α-defensins HNP-1,HNP-2,HNP-3在体外对腺病毒有着很强的抗病毒活性,并且对疱疹病毒、流感病毒和巨细胞病毒均有抑制活性;HNP-4对H IV-1感染也有一定的抑制作用[39]。更多的研究发现 β-defensins,以对抗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的感染。另有研究发现,结核杆菌感染的人肺泡巨噬细胞可以诱导 HBD-2的表达,说明 HBD-2在人类结核病的感染中起到一定作用[40]。

抗菌肽已经广泛的应用在特异性皮炎和银屑病这两种皮肤疾病的治疗中。通过服用 VD3来诱导体内 LL-37的表达,使用有益菌种或是丁酸钠来诱导肠内抗菌肽的抗感染和抗炎能力[41]。

抗菌肽可能成为一种新型的药物载体。两亲性抗菌肽的膜穿透性是其作为药物运输载体的基础,Laszlo Otvos等将分子量小且富含精氨酸残基的昆虫抗菌肽 pyrrochoricin和其衍生物作为施药运载工具,可将抗原性较弱的 9个残基的MHC-1的抗原表位递送到小鼠体内,产生很强的细胞毒性 T细胞反应,证实pyrrochoricin同系物具有运载抗原依赖性疫苗的潜力[42]。Magainin与溶于体积分数为 0.50的乙醇的表面活性剂增强剂 N-月桂酰肌氨酸一起可以破坏皮肤角质层中的脂质结构,从而增加了药物的皮肤透过性,该结果显示出抗菌肽作为透皮给药载体具有很好的发展前景[43],进一步探讨抗菌肽作为穿膜肽的应用具有广阔的前景。

抗菌肽的抗肿瘤活性为肿瘤药物的开发提供了又一个研究平台。已经证实天蚕素A和B,LL-37/hCAP-18,Magainins,Gaegurins,Aurein 1.2,Citropin 1.1,Melittin(蜂毒肽),Lactoferrici,Tachyp lesin I(鲎素 I),cathelicidin家族中的 PR-39以及一些人工合成的AMPs等有着很好的抗肿瘤活性。在研究AMPs抗肿瘤的同时,研究者通过其对肿瘤细胞的作用机制和对 AMPs本身的改造,使某些抗肿瘤AMPs不仅在抗肿瘤活性上得到提高,并大大增强了 AMPs对肿瘤细胞的靶向性[15]。

虽然始终有大量的研究人员在对天然抗菌肽提取、纯化、结构验证和改造等各方面不断地做出成绩,但是只有一小部分多肽进入临床试验阶段。几个很有希望的品种在进行三期临床试验阶段宣告失败。比如MSI-78,临床实验是用于治疗糖尿病性足溃疡感染,其疗效等同于口服氧氟沙星。同样在临床三期就宣告失败的还有 IB-367和 MBI-226。到目前为止还没有任何抗菌肽或其衍生物被FDA批准上市,多是用作食品添加剂、兽药。所以研发抗菌肽类药物还有很长的路要走。目前很多知名药物研发机构,如Micrologix仍然对抗菌肽类药物进行着不懈地探索。其中用于治疗过敏性痤疮的多肽类药物已经进入Ⅱ期临床实验阶段,用于治疗 MRSA引起的鼻腔炎症也进入Ⅰb期临床实验阶段。

2.4.2 代抗生素添加剂 根据美国相关科学家联盟的一项研究表明,美国 70%的抗生素应用于健康的动物,用来增加健康畜禽的体重。2010年 6月 28日,美国食品及药品管理局(FDA)实施了进一步限制抗生素在动物生产上的措施,主要是因为在动物饲料中常规使用抗生素导致出现抗药性的新细菌菌株。动物食品安全有赖于生产过程的各个环节,使用无污染、在动物体内无残留、无毒副作用的添加剂是解决问题的关键之一。

抗菌肽是动物体成分之一,参与生命过程是小分子短肽具有安全无毒副作用的生物学特性。抗菌肽众多的优点为其在兽医学和饲料科学中的应用指明了作为可代替抗生素的应用方向,尤其是抗菌肽分子量小、热稳定性强,因此可以耐受饲料制粒时的高温,规模化发酵生产时,经高温浓缩工序,可充分杀灭酵母菌体而不导致抗菌肽失活,产品在推广应用后不会出现工程菌的扩散而导致环境生态问题。

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(责任编辑:石瑞珍)