环介导等温扩增技术的研究进展

马艳平,刘振兴,郝 乐,林 敏,孟 轩,柯 浩

(广东省农业科学院兽医研究所广东省兽医公共卫生公共实验室,广东广州,510640)

核酸扩增是生命科学领域的常用研究工具,自 20世纪 80年代聚合酶链式反应(PCR)问世以来[1],再到以后出现的核酸等温扩增技术、再生式序列复制和链置换扩增技术等以核酸检测为基础的分子生物学技术在医学和生物学领域、医学诊断和传染性疾病的检测得到了广泛应用[2]。但由于核酸的检测需要昂贵的仪器设备,存在特异性不高、操作程序复杂等特点,大大限制了作为快速诊断方法的应用。2000年Notomi等开发了一种新的核酸等温扩增方法,即环介导等温扩增法(1oop-mediated isothermal amp lification,LAMP)。其特点是在等温条件下即可高效、快速、高特异、高灵敏地扩增靶序列[3],使其作为快速诊断成为可能。它是针对靶基因的 6个区域设计 4种特异引物,利用一种链置换 DNA聚合酶(BstDNA polymerase)在等温条件(约 65℃)保温几十分钟,即可完成核酸扩增反应。不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程。基因的扩增和产物的检测可一步完成,扩增效率高,可在 15～60m in扩增 109～1010倍[4]。所有靶基因序列的检测可只通过扩增产物的有无来判别。该技术已经广泛应用于病毒、细菌、寄生虫等方面的检测。

1 环介导等温扩增技术的原理

1.1 引物设计

针对靶基因 6个特异序列(3′端的 F3c,F2c,F1c区以及 5′端的 Bl,B2,B 3区)设计 4条引物,即上游内部引物(FIP)、上游外部引物(F3)、下游内部引物(BIP)、下游外部引物(B3)[5]。后来添加了 2条环状引物,上游环状引物(LF)和下游环状引物(LB)。

1.2 扩增程序

60～65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度,是一种动态活性温度。因此,DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物,依靠一种高活性链置换 DNA聚合酶,使得链置换DNA合成在不停地自我循环。LAMP反应过程是先由外部引物扩增出内部引物扩增所需要的模板,即起始反应物模板的合成;紧接着由内部引物引导合成靶基因 DNA片段,由于内部引物扩增的 DNA片段含有与该引物 5′端 DNA片段的反向互补序列,因而这些反向互补序列之间通过杂交形成茎环结构,另外一条内部引物与其互补链退火杂交后引导链置换合成反应,在扩增的DNA片段的另外一端产生了新的茎环结构,形成哑铃结构,如此往复循环最后形成菜花样结构[6]。LAMP的整个反应分三步完成,即起初反应物模板的合成,循环扩增阶段,延伸和再循环。

1.3 结果鉴定

1.3.1 电泳检测 LAMP的产物可以用琼脂糖凝胶电泳,紫外线灯下观察。由于产物是混合物,故呈现出特异的梯状条带,经限制性内切酶酶切之后呈现单一靶序列条带。

1.3.2 荧光检测 在 LAMP扩增产物中加入SYBR Green I荧光染料,只与双链DNA小沟结合,当它与DNA双链结合时,肉眼观察荧光染料由橘黄色变为绿色,紫外线下可以发出荧光[7],而阴性对照管颜色没有发生变化。在一个体系内其信号强度代表了双链DNA分子的数量,荧光强度检测可以用实时定量PCR仪进行。

1.3.3 浊度检测 在核酸大量合成时,从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg结合。产生副产物焦磷酸镁的白色沉淀。其具有极高的特异性。只要用肉眼观察或浊度仪在 400 nm光下检测浊度就能够判断扩增与否,并对起始模板定量,达到实时定量的检测,是最常用最便捷的检测方法[8]。

2 环介导等温扩增技术的特性

LAMP具有许多迄今为止的扩增方法无法比拟的优点。

2.1 高特异性

LAMP应用 6个区段、4种引物,并且这 6个区段的顺序也有规定。原理上LAMP扩增的特异性很高,因此可以根据是否扩增就能判断目标基因的存在与否,即能够进行细菌或病毒的定性检测。

2.2 快速、高效扩增

整个扩增在 30～60min即可完成,且产率可达到 0.15 g/L。若在引物上再进一步改进,可大大提高其扩增效率,扩增时间在原来的基础上减少1/3～1/2[9]。

2.3 高灵敏度

扩增模板可达 10拷贝或更少。能从极低微量的拷贝中扩增出目的基因,扩增效率可高达 109～1010拷贝。比传统PCR高出 2～3个数量级。

2.4 步骤简单

与传统 PCR技术相比,LAMP技术简化了94℃变性步骤,同时退火和延伸在等温条件下进行。且LAMP不需要特殊试剂,不需要预先进行双链DNA的变性[10]。另外,对RNA病毒不需要单独进行反转录反应,只要在DNA基因扩增试剂的基础上加上逆转录酶,就能够完全像DNA基因扩增那样,一步实现RNA扩增。

2.5 结果易于鉴定

在核酸大量合成时,从dNTP析出焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合,产生副产物——焦磷酸镁沉淀。它有极高的特异性,只要用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度就能判断扩增与否。

LAMP方法有其自身方法上的优点,同时又有其无法逾越的障碍,它只能有扩增和不扩增 2种结果,靶序列长度控制在 300 bp以下,一旦产生非特异性扩增,则不易鉴别,这些都无法同 PCR相比[11]。并且该方法由于采用多条引物,在同一温度下扩增,引物之间有可能互补而扩增出非特异性条带,容易造成假阳性。

3 环介导等温扩增技术的应用

环介导等温扩增技术已被用于对细菌、病毒、寄生虫的检测、动物胚胎性别鉴定等领域,在疾病的快速检测方面发展迅速,可对多种疾病进行检测和鉴定,是最有发展前景的快速诊断手段的方法之一。

3.1 病毒检测的应用

目前应用 LAMP技术检测的病毒主要有乙肝肝炎病毒、流感病毒、单纯疱疹病毒、水痘—带状疱疹病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、腺病毒、SARS冠状病毒、呼吸道合胞病毒、西尼罗河病毒等。

3.1.1 DNA病毒 Kaneko等[12]利用 LAMP检测单纯疱疹病毒(HSV)-l和 HSV-2及水痘—带状疱疹病毒(VZV)-1。Enomoto等[13]用 LAMP和PCR以及病毒分离法扩增单纯疱疹病毒(HSV)DNA,用LAMP分析法,在 50例样品中测出 10例 HSV-1阳性和 13例 HSV-2阳性;若采用 PCR分析法,则可测出 12例 HSV-1阳性和 18例 HSV-2阳性样品;若采用病毒分离法则可测出 10例 HSV-1阳性,12例 HSV-2阳性,并且没有1例表现为双阳性。由结果看,尽管对于实时 PCR分析法来说,LAMP的灵敏性是较低的,但若以病毒分离法作为比较的标准,LAMP是具有高灵敏性和高特异性的,符合临床使用的标准。

3.1.2 RNA病毒 Notom i T等[14]首先将LAMP与反转录相结合建立了 RT-LAMP技术,是反转录和等温扩增在同一反应管中进行。现已有许多报道 RT-LAMP技术用于RNA病毒的检测。如Parida等[15]用实时RT-LAMP检测西尼罗病毒包膜蛋白基因,敏感度是 RT-PCR的 l0倍,可检测 0.1 PFU病毒。Hong等[16]用 LAMP方法检测 SARS病毒,与传统 RTPCR方法相比,敏感性高 100倍,能检测出 0.0l PFU的病毒,敏感性和特异性分别是 RT-PCR法的 100%和 87%。Dukes等[17]用 RT-LAMP检测口蹄疫病毒(FMDV),能在 22min内检测出 10个拷贝的口蹄疫病毒。

3.2 细菌检测

目前应用于细菌性疾病的检测主要有结核分支杆菌、痢疾志贺菌、大肠杆菌、螺旋体、肺炎链球菌和耶氏菌等。

Iwamoto等[18]根据gyrB基因序列针对结核分支杆菌、鸟分支杆菌和胞内分支杆菌的特异引物和 16SrRNA保守序列的分支杆菌属公共引物,用LAMP方法从痰标本中鉴定结核分支杆菌、鸟分支杆菌和胞内分支杆菌。其操作非常简单,仅将所有的反应物混合后 63℃孵育,即可在反应试管中加入SYBR GreenⅠ进行检测。如果含有扩增产物,反应混合物变绿;反之,则保持 SYBR GreenⅠ的橙色不变。LAMP从固体培养基中鉴定出特异的分支杆菌属所用时间为 35min以内,而液体培养基则需 60min。

3.3 寄生虫检测

2003年 Kuboki等[19]用 LAMP成功地对非洲锥虫靶基因进行扩增后,于 2005年又用 LAMP,PCR以及寄生虫学方法(血涂片、鼠接种实验)对实验感染猪体内的埃文斯锥虫进行了检测,并对其方法进行了评价,认为LAMP技术在检测锥虫感染上与 PCR和寄生虫学方法同样敏感[20]。

3.4 胚胎性别鉴定

运用 LAMP方法进行早期胚胎性别鉴定具有简便、快速、准确、高效的特点。基于 Y染色体上特异序列的检测,可判别胚胎性别。日本株式会社[21]利用 LAMP检测牛早期胚胎的性别,显微切割胚胎提取 DNA,其性别鉴定准确率达88.9%～94.4%,切割后的胚胎移植妊娠率高,总时间在 1 h内即可完成,适用于在养殖场进行操作。

3.5 环介导等温扩增技术与其它技术相结合的应用

荧光原位杂交、原位PCR、原位RT-PCR的出现使得扩增与原位杂交相结合,极大地提高了灵敏度,但存在热循环细胞破坏和扩增产物泄露造成的高背景问题,原位LAMP技术应运而生。2003年 Maruyama等[22]用LAMP方法和原位杂交技术相结合检测大肠杆菌O157∶H 7的 stx2基因与原位PCR比较,并采用荧光抗体标记来验证。试验结果显示,相对原位PCR而言,温和的渗透性及低等温条件使得原位LAMP引起较少的细胞损伤,准确性更高。Fukuta等[23]用建立的免疫捕获反转录LAMP对感染番茄的菊花斑点枯萎病毒进行了检测,结果表明,该方法的敏感性是免疫反转录PCR的 100倍。

4 展 望

环介导等温扩增技术是本世纪发展起来的一种分子生物学技术。虽然还存在诸多的缺点和不足,但它在不断地改进和完善,在研究病原体快速检测方面有广阔的前景。鉴于LAMP技术的优点,有可能将来建立起成本低廉的检测体系。LAMP作为一种核酸扩增的快速检测方法,将会有更广阔的应用前景。

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(责任编辑:石瑞珍)