4-HPR体外诱导A549细胞凋亡与Bax/Bak蛋白相关性研究

张 玲，桂淑玉，左 莉，何 苇，周 青，汪 渊

(1.皖南医学院 生物化学教研室，安徽 芜湖 241002;2.安徽医科大学第一附属医院 呼吸内科，安徽 合肥 230022;3.安徽医科大学 分子生物学实验室，安徽 合肥 230022)

肺癌居全球癌症病死率之首，目前化学药物应用在其治疗过程中仍起到重要作用。N-(4-羟基苯基)维生素甲酰胺(4-HPR)是反式维甲酸(ATRA)的衍生物之一，它将ATRA羧基端以一个酰胺基所连接的4-羟苯基取代，是一种活性很高的凋亡诱导因子［1］。本研究观察了4-HPR对人肺腺癌细胞株A549体外生长抑制作用和诱导凋亡情况，并对其机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 试剂 ATRA和4-HPR购于Sigma公司，用二甲基亚砜(DMSO)溶解各配制成10 mmol/L的储备液，-20℃避光保存，使用前用细胞培养液稀释到所需浓度。细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒购于Beyotime公司。

1.2 实验分组、细胞培养和倒置显微镜观察 实验分6个组，即细胞对照组、溶剂对照组(1‰的DMSO)、1 μmol/L ATRA 组、5 μmol/L ATRA 组、1 μmol/L 4-HPR 组、5 μmol/L 4-HPR 组。将肺腺癌细胞A549培养于含10%小牛血清(购于杭州四季青生物公司)的DMEM(GIBICO公司)培养基中，置37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中。待细胞呈对数期生长时加药处理，3 d后倒置显微镜下观察6个处理组细胞生长情况及形态变化，并拍照记录。肺腺癌细胞株购于ATCC，由安徽医科大学分子生物学实验室保存。

1.3 Hoechst 33258凋亡染色 取普通洁净无菌处理盖玻片置于24孔板内，按4×104/孔种入细胞，次日更换培养基，按1.2中实验分组培养，每组4个实验复孔。待细胞长至约50%～60%时进行染色。吸尽培养液，固定20 min;PBS洗涤;加入Hoechst 33258染色液染色5 min;PBS洗涤;滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，使细胞生长面接触封片液。荧光显微镜调节激发波长在350 nm左右，发射波长在460 nm左右，观察细胞核形态并拍照记录。

1.4 Western Blot观察细胞Bax/Bak、P53的表达收集药物处理3 d的细胞，PBS漂洗，加入蛋白提取缓冲 液 (Tris-HCl，pH 7.4;150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1%Triton，0.1%SDS，5 mg/L Leupeptin，1 mmol/L PMSF)裂解细胞，离心收集蛋白。蛋白定量采用 BCA(Bicinchoninic acid)(PIERCE，USA)法。上样50 μg蛋白进行 SDS-PAGE电泳。然后将蛋白转移至PVDF(聚偏氟乙烯)膜上。5%脱脂奶粉封闭2 h，加入抗兔多克隆抗体Bak、P53，抗鼠单克隆抗体Bax、β-actin(Santa Cruz，USA)4 ℃孵育过夜，经PBST洗涤后再加入相应浓度的二抗(PIERCE，USA)室温孵育2 h，洗涤后在暗室中加ECL(PIERCE，USA)检测试剂，用 X线片曝光，显影，定影。

2 结果

2.1 不同实验组A549细胞生长和形态变化 药物处理3 d后，倒置显微镜下观察可见细胞和溶剂对照组及1 μmol/L ATRA组A549细胞密度大，生长旺盛，光泽度好(如图1A～C);5 μmol/L ATRA组细胞密度减小，无堆叠生长，但形态改变不明显(如图1D);1 μmol/L 和5 μmol/L 4-HPR 组细胞数量明显减少，生长稀疏，光泽度下降，细胞变小变圆，失去正常生长，高浓度组现象更明显(如图1E、F)。与前期研究［2］MTT实验结果相吻合。

2.2 不同实验组诱导A549细胞凋亡 不同浓度药物处理3 d后，行Hoechst染色检测细胞凋亡情况。显微镜下可见1 μmol/L ATRA组(如图2C)细胞核与对照组(如图2A、B)区别不大;5 μmol/L ATRA组(如图2D)细胞核数目相比对照组减少，有凋亡小体出现;1 μmol/L 4-HPR 和 5 μmol/L 4-HPR处理组(如图2E、F)细胞核数目较对照组明显减少，细胞核致密浓染或碎裂，折光性增强，高浓度组更明显。与我们前期研究［2］流式细胞术检测调亡的结果相吻合。

2.3 不同实验组对A549细胞凋亡相关蛋白表达的影响 收集药物处理3 d的A549细胞，提取蛋白后行Western blot检测凋亡相关蛋白表达情况。从图3 可以看出，1 μmol/L 4-HPR 和5 μmol/L 4-HPR处理组促凋亡蛋白Bax/Bak的表达增加;转录调节因子P53表达亦增加，并随药物浓度的提高而显著增强。1 μmol/L ATRA组蛋白表达变化不明显，5 μmol/LATRA组促凋亡蛋白Bax/Bak以及P53的表达亦增加。

3 讨论

肺腺癌在各类肺癌中约占20% ～30%，女性病人多见，男性亦有增多趋势，发病年龄较小，早期一般没有明显临床症状，易发生早期转移，病死率较高。对放疗不敏感，化疗仍是其目前主要治疗方法。4-HPR是ATRA衍生物之一，与其他维甲酸类化合物相比其毒性小，在临床上已经成为非常有潜力的癌症预防药物［3］。它能抑制多种类型的肿瘤细胞增殖，包括头颈鳞癌［3］、肺癌［4］、乳腺癌［5］等。本课题组前期实验［2］和现阶段研究均显示其有明显的抑制肺腺癌A549细胞增殖，诱导凋亡的作用。抗癌促凋亡机制目前仍不清楚。有报道显示4-HPR诱导一些类型的头颈部鳞癌和非小细胞肺癌细胞的凋亡，不能被抗氧化剂和 RAR特异阻断剂所抑制［1］。前期研究［2］显示其诱导凋亡与抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xS/L表达下降相关，提示4-HPR诱导细胞凋亡机制可能与Bcl-2家族相关。Bcl-2家族蛋白位于线粒体信号通路上游，对线粒体诱导的凋亡具有重要的调节作用［6］。根据Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡中的功能分为两类，一类是抗凋亡的，如:Bcl-2、Bcl-xS/L等;一类是促进凋亡的，如 Bax、Bak等。Bax/Bak位于胞浆，激活后转位到线粒体膜上，能够在线粒体外膜形成同源聚合物，促进凋亡因子的释放，诱导细胞凋亡。Bcl-2、Bcl-xS/L通过与促凋亡蛋白形成异源二聚物抑制Bax/Bak的活化。本次实验Western Blot检测Bax/Bak蛋白表达显示:药物作用同时，促凋亡蛋白Bax/Bak表达增多。验证了之前的推论。

本次研究亦观察到P53蛋白表达在4-HPR诱导A549细胞凋亡过程中显著提高。P53是抑癌基因p53表达的蛋白，与细胞周期的调控、细胞分化、细胞凋亡等重要生物学功能有关。相关报道指出山楂酸诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡是通过激活P53促发线粒体相关凋亡通路，伴有Bax表达增加和Bcl-2表达减少［7］;生长抑素诱导大肠癌细胞凋亡的同时伴随Bax的高表达，P53和Bcl-2的低表达［8］;国内亦有研究指出4-HPR在体内外抑制肝癌细胞增殖的过程中，出现P53过表达和Bcl-2/Bax表达比率下降［9］。以上均提示4-HPR诱导肺腺癌A549细胞凋亡可能依赖P53的Bcl-2家族通路来发挥作用。

ATRA是4-HPR的前体，在研究中作为对照药物，对于该药体外抑制细胞增殖、诱导凋亡和作用机制一并进行了探讨。相继研究结果表明［2，10］，高浓度组(5 μmol/L)有较弱抑制细胞增殖、促进凋亡的作用，凋亡相关蛋白表达水平亦有一定改变。综合国内外报道［11，12］，考虑 ATRA 对 A549 细胞作用可能以促进分化为主。

总之，4-HPR通过上调Bax/Bak的表达促进A549细胞凋亡，P53参与该药物作用的信号通路，凋亡作用机制的进一步阐明，将为肺腺癌病人的治疗提供新思路。

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