痛风颗粒HPLC指纹图谱研究Δ

2011-08-07徐玲玲上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院药剂科上海市200437

中国药房 2011年31期

徐玲玲，徐熠，年华（上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院药剂科，上海市 200437）

痛风颗粒由茵陈、连钱草、伸筋草等药物组成，具有清热、利湿、通络的作用，常用于治疗慢性痛风、关节炎等症，临床疗效显著。方中以茵陈作为君药，取其清利湿热、芳香舒脾、透表畅气之效；以连钱草作为臣药，取其消石之功，防止痛风性尿路结石的产生，配伍茵陈可以增强其利湿通络的作用；加之伸筋草祛风除湿、舒筋活血，达到通络的作用。该方中主要含有绿原酸[1]、黄酮[2]、石松碱[3]等多种化学成分，多靶点地对慢性痛风性关节炎起到治疗效果[4]。目前，单对一种成分进行质量控制已经达不到有效控制和评价中药复方制剂的目的。因此，本试验对痛风颗粒进行高效液相色谱（HPLC）指纹图谱研究，以期为痛风颗粒的质量控制研究提供思路。

1 仪器与试药

1200型HPLC仪（美国Agilent公司）；BS124S电子天平（德国Sartorius公司）；B5200S-DT超声提取器（必能信超声（上海）有限公司）。

绿原酸对照品（批号：0753-200111）、伸筋草（批号：121109-200401）、茵陈（批号：950-200204）均由中国药品生物制品检定所提供；连钱草（上海同济堂药业有限公司，批号：090801，经上海中药质量监督检验室叶愈青副主任药师鉴定为真品）；甲醇（色谱纯，批号：Lot.096964）、乙腈（色谱纯，批号：Lot.100751）均购自美国Fisher Scientific公司；异丙醇（分析纯，美国TEDIA公司，批号：Lot.909904）；磷酸为分析纯，水为双蒸水；痛风颗粒（上海上联药业有限公司，批号：081001、090501、090502、090701、090722、090901、091001、091101、100101、100401）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.05%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0 min，4%B；20 min，80%B；40 min，32%B；50 min，36%B；50～55 min，4%B）；柱温：20 ℃；流速：1 mL·min-1；进样量：10 μL；检测波长：327 nm。

2.2 对照品溶液的制备

取绿原酸对照品适量，用甲醇溶解稀释成64 μg·mL-1的对照品溶液，过0.45 μm微孔滤膜，备用。

2.3 供试品溶液的制备

取痛风颗粒2.5 g，精密称定，研细，置于具塞锥形瓶中，加50%甲醇超声（工作频率：42 kHz，功率：260 W）30 mim，过滤，取续滤液5 mL，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，备用。

2.4 方法学考察

2.4.1 图谱测定时间的确定取供试品溶液进样10 μL，按上述色谱条件进行梯度洗脱，记录120 min。结果，40 min后无有意义峰出现，故图谱测定时间确定为55 min。

2.4.2 参照物的确定痛风颗粒的处方药材含有机酸、黄酮、生物碱等多种有效成分。通过对供试品和对照品的图谱比较（见图1），综合考虑出峰面积、出峰时间及分离度等因素，发现绿原酸在制剂中的含量最高、色谱峰分离度较好且纯度较高，因此采用绿原酸作为参照物。

图1 供试品溶液和绿原酸对照品溶液的HPLC对照图谱Fig 1 HPLC chromatograms of test sample and chlorogenic acid control

2.4.3 精密度试验精密称取痛风颗粒（批号：090722）2.5 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，连续重复进样6次，记录指纹图谱并分析。结果，各共有峰相对保留时间的RSD为0.00%～0.20%，相对峰面积的RSD为0.00%～2.89%，相似度为0.999～1，表明本方法精密度良好。

2.4.4 重复性试验精密称取痛风颗粒（批号：090722）适量，共6份，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样，记录并分析。结果，各共有峰相对保留时间的RSD为0.00%～0.09%，相对峰面积的RSD除4、14～17号峰外，均＜3%，相似度为0.999～1，表明本方法重复性良好。

2.4.5 稳定性试验精密称取痛风颗粒（批号：090722）适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、24 h进样，记录并分析。结果，各共有峰相对保留时间的RSD为0.00%～0.47%，相对峰面积的RSD除10～11、13、16、19～21号峰外，均＜3%，相似度为0.998～1，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5 样品指纹图谱测定

取10批痛风颗粒各适量，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样，记录，比较色谱图（见图2、图3），确定共有峰为21个。

图2 痛风颗粒的HPLC图Fig 2 HPLC chromatograms of Tongfeng granules

图3 10批痛风颗粒的HPLC指纹图谱Fig 3 HPLC fingerprints of 10 batches of Tongfeng granules

2.6 相似度计算

采用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004 A版）》软件对10批样品进行相似度分析。以S1为参照得出对照指纹图谱，以此为基础进行整体相似度评价。结果，相似度评价结果均＞0.9（见表1），表明10批样品中的化学成分较一致。

2.7 指纹图谱共有峰的归属

按痛风颗粒制备工艺，分别制备茵陈、连钱草和伸筋草药材的供试品溶液，按已建立的指纹图谱色谱条件进行检测，与痛风颗粒的全图谱进行比较。结果表明，在痛风颗粒指纹图谱21个峰中，有16个峰归属茵陈（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、18、19、20），其中4、11号峰为茵陈特征峰；11个峰归属连钱草（1、2、3、7、8、10、13、14、15、20、21），其中14、15、21号峰为连钱草的特征峰；11个峰归属伸筋草（1、2、5、6、7、9、10、12、13、16、17），其中16、17号峰为伸筋草的特征峰。

表1 痛风颗粒的指纹图谱相似度Tab 1 Similarity degree of the fingerprints of Tongfeng granules

3 讨论

3.1 色谱柱的确定

由于不同型号和不同厂家的色谱柱存在填料及性能上的差异，会影响试验结果，因此对J’sphere ODS-H80（150 mm×4.6 mm，5 μm，日本YMC公司）、ZORBAX Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm，美国安捷伦公司）和ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm，美国安捷伦公司）3种色谱柱进行比较。结果表明，J’sphere ODS-H80和ZORBAX SB-C18的出峰效果优于ZORBAX Eclipse XDB-C18，且所出峰较多；而ZORBAX SB-C18各峰的分离度优于J’sphere ODS-H80，因此采用ZORBAX SB-C18作为试验用色谱柱。

3.2 流动相的确定

本试验考察了甲醇-0.05%磷酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液、乙腈-水、甲醇-1%醋酸水溶液、乙腈-1%醋酸水溶液作为流动相的分离效果。结果，由于乙腈-0.05%磷酸水溶液的分离度较佳，故最后选其作为试验用流动相。

3.3 柱温的确定

分别在20、30、40℃的柱温条件下对样品的分离效果进行考察。结果表明，随着柱温的升高，各色谱峰的出峰时间明显提前。在30与40℃柱温条件下，17～25 min区间的几组峰的分离效果较20℃柱温条件下更差，故采用20℃柱温作为试验条件。

3.4 检测波长的确定

试验考察了327、254、280 nm波长条件下可获取的色谱图。结果表明，痛风颗粒中的成分在327 nm波长条件下有较好的响应。比较各个峰的吸收波长，发现均在320～330 nm区间有最佳吸收，因此选用327 nm作为检测波长。

3.5 提取溶剂的考察

分别采用70%乙醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇作为提取溶剂，进行色谱图比较。结果表明，70%乙醇与70%甲醇比较，70%甲醇的提取成分较多，提取率较高，因此采用甲醇作为提取溶剂；再比较70%、50%、30%甲醇提取的图谱，发现50%和30%甲醇的提取效果明显优于70%甲醇的提取效果，而50%甲醇提取效果要略高于30%甲醇，因此采用50%甲醇作为提取溶剂。